用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法.docx

毕业设计（论文）

PAGE

1-

毕业设计（论文）报告

题目：

用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

学号：

姓名：

学院：

专业：

指导教师：

起止日期：

用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

摘要：犬腺病毒（Canineadenovirus,CAdV）是一种高度传染性的病毒，可引起犬类多种疾病。为了快速、准确地检测CAdV，本研究设计了一套基于重组蛋白扩增技术（RPA）的检测方法，包括RPA引物对、探针、试剂盒及其应用。通过优化反应条件，实现了对CAdV的高灵敏度检测。本研究结果为CAdV的快速诊断提供了技术支持，对犬类疾病的防控具有重要意义。

犬腺病毒（Canineadenovirus,CAdV）是犬类常见病毒性疾病之一，由犬腺病毒感染引起。该病毒具有高度的传染性，可引起犬类急性呼吸道疾病、肝炎、肠炎等多种疾病，严重威胁犬类健康。目前，CAdV的检测方法主要有病毒分离培养、血清学检测、分子生物学检测等。其中，分子生物学检测方法具有灵敏度高、特异性强等优点，是CAdV诊断的重要手段。本研究旨在设计一套基于重组蛋白扩增技术（RPA）的CAdV检测方法，为CAdV的快速诊断提供技术支持。

一、1.CAdV引物设计与合成

1.1引物设计原则

引物设计是分子生物学实验中至关重要的一步，尤其是在病毒检测领域，引物的设计质量直接影响到检测的灵敏度和特异性。在设计犬腺病毒（CAdV）的引物时，遵循以下原则至关重要。首先，引物序列应具有高度特异性，以避免非特异性扩增。为此，通过对CAdV基因组序列的全面分析，选择与宿主基因组中其他基因无同源性的区域，确保引物仅针对CAdV进行扩增。例如，在CAdVE1基因的保守区域设计引物，通过生物信息学工具如BLAST进行同源性有哪些信誉好的足球投注网站，确保所选序列在宿主基因组中不存在相似序列。

其次，引物长度通常设定在18-25个碱基之间，这样的长度既能保证足够的特异性，又能确保引物与模板的结合效率。引物的GC含量（G+C比例）应介于40%-60%之间，以维持引物在DNA聚合酶作用下的稳定性和适宜的Tm值。研究表明，Tm值与引物序列中的GC含量密切相关，GC含量越高，Tm值越高。以本研究设计的CAdV引物为例，其GC含量为50%，Tm值为62°C，这样的Tm值有利于在PCR反应中维持引物的稳定结合。

最后，引物两端应避免存在二级结构，如发夹结构或二级结构倾向区域，因为这些结构可能会影响引物的延伸效率。设计过程中，使用分子生物学软件对引物进行二级结构预测和退火温度分析，确保引物在反应条件下能够有效结合。例如，在引物设计时，通过软件分析发现，设计的引物在特定条件下无二级结构形成，从而保证了PCR反应的顺利进行。此外，引物之间的互补性也需要考虑，避免引物二聚体的形成，因为二聚体可能会干扰PCR反应的特异性扩增。通过以上设计原则，本研究成功设计了一套针对CAdV的引物，为后续的RPA检测提供了可靠的基础。

1.2引物合成与鉴定

(1)引物合成的关键步骤包括序列设计、合成原料准备、自动化合成反应以及纯化。在本研究中，根据设计的引物序列，我们选择了高纯度的DNA合成原料，并在全自动DNA合成仪上进行了合成。合成过程中，采用了三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTPs）作为原料，保证了引物序列的准确性。合成完成后，通过高效液相色谱（HPLC）对引物进行纯化，去除未反应的原料和副产物，确保了引物纯度达到99%以上。

(2)引物合成后，通过聚合酶链反应（PCR）和凝胶电泳对引物进行鉴定。以本研究设计的CAdV引物为例，我们采用50μl的PCR反应体系，其中包含1μl的10μM引物，2μl的10×PCR缓冲液，1μl的2.5mMdNTPs混合物，0.25μl的10μM正向引物，0.25μl的10μM反向引物，0.125μl的5U/μl的TaqDNA聚合酶以及8.875μl的去离子水。PCR反应条件为：95°C预变性5分钟，然后进行35个循环（95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分钟），最后在72°C延伸7分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示两条特异性条带，与预期引物长度一致。

(3)此外，为了进一步验证引物的特异性，我们采用了琼脂糖凝胶电泳和DNA测序方法。首先，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察特异性条带。结果表明，在预期的位置出现了两条清晰的条带，证实了引物的特异性。随后，对PCR产物进行测序，测序结果与设计的引物序列完全一致，进一步证实了引物的正确性和特异性。这些鉴定结果表明，所合成的CAdV引物可以用于后续的RPA检测，为CAdV的快速诊断提供了可靠的分子生物学工具。

1.3引物特异性验证