聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2).ppt

由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。第28页，共45页，星期日，2025年，2月5日第29页，共45页，星期日，2025年，2月5日实验过程凝胶制备样品处理与加样电泳剥胶与固定染色与脱色安装电泳槽第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日实验步骤一、制胶1.配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而有不同的配制方法。（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度＜10420%～30%1×104～4×10415%～20%4×104～1×10510%～15%1×105～5×1055%～10%＞5×1052%～5%第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）----3.0浓缩胶缓冲液（pH6.8Tris-HCl）----1.2510%SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸馏水11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.05第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日1、作用分离蛋白质、核酸2、概念聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）3、原理第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日（1）丙烯酰胺结构式第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日（2）亚甲双丙烯酰胺第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日PAGE的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。（1）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日注意：?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日（2）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据亚