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猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gd基因序列分析

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猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gd基因序列分析

摘要：猫疱疹病毒1型（FHV-1）是一种常见的猫病毒，可引起猫的多种疾病。本研究旨在分离鉴定猫疱疹病毒1型，并通过基因测序分析其gd基因序列。首先，从临床样本中分离得到病毒，并通过病毒培养和形态学观察进行鉴定。其次，通过PCR扩增gd基因片段，并进行测序和序列分析。最后，将测序结果与已知的FHV-1序列进行比对，分析gd基因的序列特征和进化关系。本研究为FHV-1的诊断、治疗和防控提供了理论依据。

猫疱疹病毒1型（FHV-1）是猫科动物常见的一种病毒，可引起猫的多种疾病，如口炎、角膜结膜炎、皮肤病等。FHV-1的流行给养猫家庭和兽医临床带来了很大的困扰。因此，深入研究FHV-1的分子生物学特性，对提高FHV-1的诊断、治疗和防控水平具有重要意义。本研究旨在通过分离鉴定猫疱疹病毒1型，并对其gd基因进行序列分析，为FHV-1的深入研究提供基础数据。

一、1.猫疱疹病毒1型的分离与鉴定

1.1分离病毒样本的采集与处理

(1)在本次研究中，病毒样本的采集主要来自我国多个地区的宠物医院和兽医诊所。采集对象为疑似患有猫疱疹病毒的病猫，共计100只。样本采集前，所有病猫均经过临床诊断，确诊为猫疱疹病毒感染。采集过程中，采用无菌操作技术，分别采集了每只病猫的口腔黏膜、眼分泌物、鼻涕以及皮肤病变部位的病料。样本采集后，立即置于含有抗生素的保存液中，以防止病毒活性降低。在采集过程中，共收集到有效样本90份，有效率为90%。

(2)样本采集后，对采集到的病料进行了初步的形态学观察。通过显微镜观察，发现病料中存在大量的圆形或椭圆形病毒颗粒，大小约为100-200纳米。此外，还观察到病料细胞出现典型的细胞病变现象，如细胞肿胀、变性、核固缩等。这些形态学特征表明，所采集的病料中存在猫疱疹病毒。

(3)为了进一步验证病毒的存在，对采集到的病料进行了病毒分离实验。实验过程中，采用细胞培养方法，将病料接种于Vero细胞，37℃、5%CO2条件下培养。在病毒分离过程中，观察细胞病变情况。经过连续观察，发现接种病料的细胞在第3天出现明显的细胞病变，细胞形态发生改变，细胞融合现象明显。在第5天，细胞病变达到高峰，病毒分离成功。实验结果显示，本次分离得到的病毒与猫疱疹病毒1型具有高度同源性。

1.2病毒的培养与形态学观察

(1)在病毒培养阶段，我们采用了Vero细胞作为宿主细胞，这是因为Vero细胞对猫疱疹病毒1型（FHV-1）具有较高的易感性，能够有效地支持病毒的增殖。实验中，将分离得到的病毒颗粒接种于长满细胞的培养皿中，接种量为每孔100μL。接种后，将培养皿置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育。在病毒吸附阶段，细胞与病毒颗粒共同孵育1小时，以确保病毒充分吸附到细胞表面。随后，弃去病毒上清，用含有2%胎牛血清的DMEM培养基洗涤细胞两次，以去除未吸附的病毒颗粒。

(2)接种病毒后，每隔24小时观察细胞病变情况。在第2天，观察到接种病毒的细胞开始出现轻微的细胞肿胀现象。到了第3天，细胞病变明显加剧，细胞出现明显的皱缩、变圆和融合，部分细胞开始脱落。这一现象与FHV-1感染Vero细胞的典型细胞病变特征相符。在第4天，细胞病变达到高峰，几乎所有细胞都出现病变。为了定量分析细胞病变的程度，我们采用半数组织细胞感染量（TCID50）测定法，结果显示，病毒感染后的Vero细胞的TCID50值为10^-4.5/mL，表明病毒具有较高的感染力。

(3)在细胞病变高峰期，我们对细胞进行了进一步的形态学观察。通过光学显微镜观察，可以看到细胞膜破裂、细胞核固缩、细胞质内出现空泡等典型的细胞病变特征。此外，我们还采用电子显微镜对病变细胞进行了观察，发现病毒颗粒主要分布在细胞膜和细胞质中，大小约为100-200纳米，形态呈球形。这些观察结果与FHV-1的形态特征一致，进一步证实了所分离的病毒为猫疱疹病毒1型。在后续的实验中，我们还对病毒进行了传代培养，以确保病毒株的稳定性和可重复性。通过连续传代，病毒株的感染力保持稳定，为后续的基因测序和序列分析提供了可靠的病毒材料。

1.3病毒的鉴定

(1)为了对分离得到的病毒进行鉴定，我们首先进行了病毒的形态学观察。通过电子显微镜观察，病毒颗粒呈现典型的圆形或椭圆形，大小在100-200纳米之间。病毒颗粒表面光滑，无明显的突起或分支。这一形态学特征与猫疱疹病毒1型（FHV-1）的描述相符。

(2)随后，我们对病毒进行了血清学检测，以进一步确认病毒的种类。通过间接