菌种选育方法.ppt

*紫外-NaNO2复合诱变育种优势菌群紫外线辐射NaNO2处理驯化培养正突变菌株性状菌株氧化活性/μLO2·L-1min-1比生长速率/h-1传代时间/h在矿物表面吸附平衡时间/h原始菌0.1－0.130.058-0.1166－1224－28改良菌0.9－1.10.1783.91－7改良菌的性状远优于原始菌第30页，共57页，星期日，2025年，2月5日*紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF7658（产淀粉酶）的斜面4-5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右时倒平板，凝固后待用。第31页，共57页，星期日，2025年，2月5日*紫外线诱变紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。第32页，共57页，星期日，2025年，2月5日*培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。第33页，共57页，星期日，2025年，2月5日*B快中子中子产生：中子可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成的。快中子：中子分为快中子和慢中子。慢中子的效应同α射线、γ射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、γ射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。剂量：用快中子进行诱变育种时，用菌悬浮液或长在平皿上的菌落进行处理，所用剂量范围约为100—1500戈。第34页，共57页，星期日，2025年，2月5日*C氮芥氮芥是一种极易挥发的油状物，一般使用它的盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。ClCH2CH2ClCH2CH2NH·HCl其盐酸盐结构式为：第35页，共57页，星期日，2025年，2月5日*氮芥的诱变机制、解毒诱变机制：氮芥能引起染色体畸变，是被利用得最早的一种诱变剂。青霉素产生菌的选育，获得了良好的效果。解毒：氮芥盐酸盐在碳酸氢钠溶液中呈游离状态，甘氨酸能与氮芥(在碳酸氢钠参与下)结合，形成无毒化合物，因此它有解毒作用。其反应式为：第36页，共57页，星期日，2025年，2月5日*氮芥使用方法配制活化剂和解毒剂称取碳酸氢钠68mg加入蒸馏水10mL，即为活化剂；称取碳酸氢钠136mg,甘氨酸120mg,溶解在200mL蒸馏水中，即为解毒剂。将这两种溶液高压灭菌备用。将一只小瓶和橡皮塞灭菌、烘干、称取约10mg的氮芥盐酸盐放入瓶中，再加入灭菌蒸馏水2mL，则成为每毫升含有5mg的氮芥盐酸盐溶液。第37页，共57页，星期日，2025年，2月5日*氮芥使用方法吸取1mL孢子悬浮液(浓度为200万孢子／mL)于另一灭过菌的小瓶中，加入0.6mL缓冲液，再加入0.4mL上述氮芥溶液，将橡皮塞盖紧，摇匀，此时瓶中的氮芥作用浓度为每毫升1mg。加入氮芥溶液30秒钟后开始计算时间，达到所需要的时间后，用1mL注射器吸取0.1mL处理液加到9.9mL的解毒剂中，使氮芥作用停止。第3