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犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

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犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

摘要：犬传染性肝炎病毒（Caninehepatitisvirus,CHV）是一种重要的犬类传染病病原体，其Hexon基因编码的Hexon蛋白在病毒颗粒组装和感染过程中发挥关键作用。本研究旨在优化Hexon基因的原核表达条件，并探讨表达蛋白的活性。通过优化表达宿主、诱导剂、温度、pH值等条件，成功实现了Hexon蛋白的高效表达。对表达蛋白进行活性检测，结果表明该蛋白具有与天然Hexon蛋白相似的功能，为后续研究提供了重要的工具蛋白。

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白作为一种重要的病毒颗粒组装和感染过程中的关键蛋白，其表达和功能研究对于了解病毒感染机制和开发疫苗具有重要意义。目前，Hexon蛋白的表达和活性研究主要集中在真核表达系统，而原核表达系统因其操作简便、成本低廉等优点，成为研究Hexon蛋白的理想平台。本研究通过对Hexon基因原核表达条件的优化，旨在提高Hexon蛋白的表达量和活性，为后续研究提供有力支持。

一、1.Hexon基因的原核表达载体的构建

1.1Hexon基因的克隆与测序

(1)Hexon基因是犬传染性肝炎病毒（CHV）的重要基因之一，其编码的Hexon蛋白在病毒颗粒的组装和感染过程中起着至关重要的作用。本研究首先从CHV基因组中成功克隆出Hexon基因，利用PCR技术扩增目的基因片段，经过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到约700bp的特异性条带，与预期大小相符。随后，将扩增的Hexon基因片段与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-Hexon。转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。

(2)为了确保Hexon基因的准确性和完整性，对阳性克隆进行了测序验证。测序结果显示，Hexon基因的核苷酸序列与已发表的CHVHexon基因序列完全一致，表明克隆得到的Hexon基因是正确的。此外，通过生物信息学分析，预测Hexon蛋白的氨基酸序列，结果显示Hexon蛋白包含4个跨膜区，符合病毒膜蛋白的特性。进一步分析Hexon蛋白的二级结构，预测其主要由α-螺旋和β-折叠构成，与已知CHVHexon蛋白的结构特征一致。

(3)在后续研究中，将构建的重组表达载体pET-28a(+)-Hexon转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，进行IPTG诱导表达Hexon蛋白。通过Westernblotting检测表达产物，观察到约70kDa的条带，与Hexon蛋白的理论分子量相符。此外，通过SDS分析，表达产物在目的条带位置出现明显的蛋白条带，表明Hexon蛋白在原核表达系统中得到了有效表达。这些结果为后续的Hexon蛋白活性研究奠定了基础。

1.2表达载体的构建

(1)在构建表达载体之前，首先对Hexon基因进行了克隆和序列分析，确保其准确性和完整性。接着，选择合适的原核表达载体pET-28a(+)，该载体具备T7启动子、核糖体结合位点（RBS）和多个克隆位点，适合于在大肠杆菌中高效表达外源蛋白。通过PCR技术从CHV基因组中扩增Hexon基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳验证其大小。随后，利用T4连接酶将PCR产物与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-Hexon。

(2)在连接过程中，严格控制连接反应条件，包括连接酶的活性、连接时间和连接缓冲液的组成，以确保连接效率。连接产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，观察到约700bp的特异性条带，与预期大小一致。随后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆。为验证重组载体的正确性，对阳性克隆进行PCR和测序分析。PCR结果显示，Hexon基因片段在阳性克隆中成功插入，测序结果显示Hexon基因序列与预期序列完全一致。

(3)为了进一步验证重组表达载体的功能，将阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，并采用IPTG诱导表达Hexon蛋白。通过Westernblotting检测表达产物，观察到约70kDa的条带，与Hexon蛋白的理论分子量相符。此外，通过SDS分析，表达产物在目的条带位置出现明显的蛋白条带，表明Hexon蛋白在原核表达系统中得到了有效表达。通过优化表达条件，如温度、pH值、IPTG浓度等，进一步提高了Hexon蛋白的表达量。最终，成功构建了具有高效表达Hexon蛋白能力的重组表达载体pET-28a(+)-Hexon，为后续研究提供了基