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RNA-Seq定量分析简介

概要

背景介绍

分析思路

应用

常见问题

RNA-Seq简介

RNA-Seq：也叫全转录组测序，利用高通量测序技术对cDNA序列

进行测序，从而获得样品中RNA的信息：定量和定性。

定量：差异基因筛选、功能注释等

定性：可变剪切、SNP、基因融化等

医学领域：发现药物靶点与阐明药物作用机制，促进药物研发的进展

农业领域：找出具有重要功能的基因，为分子育种、病虫害防治、环

境治理等具有重要的作用

主要优点

数字化信号

背景噪音低

检测基因数多

检测阈值宽

可重复性高

准确性好

只被RNA-Seq检测到的基因

RNA-Seq和芯片共同检测到的基因

分析思路

•获取测序数据

•准确定位到参考序列

•表达量统计

•差异基因筛选

•功能富集分析

建库测序

总RNA提取

mRNA富集

cDNA文库制备

上机测序

RNA-Seq实验流程

数据获取

总RNA提取获得测序数据（FASTQ）后：

1.评价数据质量

工具:FastQC

mRNA富集

http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/

projects/fastqc/

cDNA文库制备2.过滤杂质数据

a)空载测序接头序列

b)控制reads中unknown碱基比例

上机测序

c)控制read的整体测序质量

RNA-Seq实验流程

数据质控

数据质控

RNA-Seq数据过滤

a.去除含adapter的reads

b.去除N的比例大于10%的reads

c.去除低质量reads（质量值Q≤5的碱基数占整个read的50％以上）

定位到参考序列-比对

常用比对软件：SOAP2、BWA、Tophat(bowtie)

比对软件的比较

SESOAP2:3misbowtie:3misbwa:3mis

Map-reads(%)withsimulationdata96.5196.5399.68

TimeconsumedwithMAQC(min)77117

Memory(G)withMAQC