exp四五碱性磷酸酶提纯比活性测定.pptx

Exp.4ExtractionandPurificationofAlkalinePhosphatase(ALP)碱性磷酸酶的提取和纯化

Purpose（目的）掌握有机溶剂法提取、纯化酶的原理和方法Mastertheprincipleandmethodofextractionandpurificationofenzymebyorganicsolvent

Principle（原理）有机溶剂（乙醇、丙酮、正丁醇等）通过降低酶的溶解度而使酶沉淀析出抑制蛋白质的解离对酶蛋白的脱水作用

所用试剂的作用：试剂作用NaAc(低浓度)低渗破膜Mg(Ac)2保护和稳定ALP的作用正丁醇使部分杂蛋白变性丙酮33%ALP溶解50%ALP沉淀乙醇30%AKP溶解60%ALP沉淀

量杯转移10ml肝匀浆(A液)至锥形瓶加入2.5ml正丁醇，摇动约3分钟室温放置10分钟，滤纸过滤滤纸不要用水打湿！！注意刻度吸管取4ml滤液于锥形瓶加4ml冷丙酮，混匀后倒入试管上清

（弃去）沉淀慢慢滴加，边加边摇动观察并记录现象。Operation（操作）离心3500rpm，5分钟转移有机溶剂用刻度吸管收集滤液于试管内

沉淀加4mlMg(Ac)2,搅拌溶解,得到悬液（B液）记录B液体积V10.2mlB液B1液加1.8mlTris剩余悬液(V1-0.2)入锥形瓶加乙醇至30%,滴加同时摇匀V=0.45(V1-0.2)沉淀

（弃去）上清用量杯计量倒入锥形瓶记录上清体积V2加乙醇至60%,滴加同时摇匀V=0.83V2上清

（弃去）沉淀观察并记录现象试管中离心3500rpm,5分钟试管中离心3500rpm,5分钟

沉淀刻度吸管取3mlMg(Ac)2溶液,搅拌溶解记录体积V3V=0.49V3上清用量杯计量倒入锥形瓶沉淀

（弃去）加丙酮至50%,滴加摇匀，记录上清体积V4上清

（弃去）沉淀加适量Tris缓冲液溶解C液V=0.34V4留取B1、C液量杯计量倒入锥形瓶，加丙酮至33%试管中离心3500rpm,5分钟试管中离心3500rpm,5分钟观察并记录现象

注意事项：①低温②滴加有机溶剂入锥形瓶，边加摇匀④短时离心⑤沉淀\上清液（弃、留）③用刻度吸管准确转移有机溶剂防止酶失活！

Results（结果）记录(V1-V4)的体积及各有机溶剂所加的量体积(ml)溶剂体积(ml)V1乙醇V2乙醇V3丙酮V4丙酮Vc

被稀释液名称ABA1取被稀释液量(ml)0.200.200.50Tris缓冲液(ml)3.801.801.50稀释后名称A1B1A2稀释倍数20104上交B1和C液保存

有机溶剂提取与纯化酶操作中的注意事项和自己的心得体会预习实验七、碱性磷酸酶比活性测定Thinkanddiscussion（思考与讨论）

SpecificactivityassayofAKP

碱性磷酸酶比活性测定Exp.5

目的（Purpose）1、学习酶的活性，比活性的测定方法。Learnthemethodoftheassayofenzymeactivityandspecificactivity.2、掌握酶的活性，比活性，得率和纯化倍数的概念。Mastertheconceptsofenzymeactivity,enzymespecificactivity,yieldandthefoldsofpurification.

概念（concepts）1.酶活性(enzymeactivity)：通常指酶对特定化学反应的催化能力。本实验中，碱性磷酸酶在37oC保温15分钟的条件下催化磷酸苯二钠底物水解产生1毫克酚定义为一个活性单位。2.比活性(Specificactivity):每毫升样品碱性磷酸酶活性单位数/每毫升样品蛋白质毫克数。表明酶的纯度。3.得率(%，yield):各阶段酶的总活性单位/原始匀浆液中酶的总活性单位。表明各阶段产出率。4.纯化倍数(thefoldsofpurification):各阶段比活性数/原始匀浆液比活性总数。表明纯化的效果。

O-P=OONaONa磷酸苯二钠+H2OAKPOHHO-P=OONaONa+C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=OH3C-NOH+C6H5NH3C-NH3C-CC-N=C=OH3C-NOK3Fe(CN)