流式细胞仪简介和使用方法.ppt

第31页，共83页，星期日，2025年，2月5日第32页，共83页，星期日，2025年，2月5日抗体标记荧光素及其他荧光染料荧光激发及发射原理能量级激发激发态发射激光能量损失第33页，共83页，星期日，2025年，2月5日标记抗体常用荧光素FITC激发光：488nm发射光：525nm;使用面最广，价格便宜AlexaGreen具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱第34页，共83页，星期日，2025年，2月5日PE激发光488nm发射光575nm此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素价格较FITC昂贵第35页，共83页，星期日，2025年，2月5日PE-Cy5TC激发光488nm,发射光667nm为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行三色分析第36页，共83页，星期日，2025年，2月5日PE-Cy7激发光488nm，发射光767nm为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小第37页，共83页，星期日，2025年，2月5日APC激发光633nm，发射光660在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。第38页，共83页，星期日，2025年，2月5日核酸染料第39页，共83页，星期日，2025年，2月5日细胞膜电位、离子、脂类探针现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。详细信息，见细胞探针公司网站：www.molecularP第40页，共83页，星期日，2025年，2月5日与流式细胞仪相关的荧光术语MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为650~1150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内第41页，共83页，星期日，2025年，2月5日第二部分流式细胞仪使用一般方法及技巧第42页，共83页，星期日，2025年，2月5日上机检测样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测打开流式细胞仪：预热及进行质控程序选择相应的方案或新建方案加载或重新调节各参数上样检测第43页，共83页，星期日，2025年，2月5日技巧一：定位目标细胞群体寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群第44页，共83页，星期日，2025年，2月5日技巧二：阴性对照阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标）使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器）对与非抗体染色，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。第45页，共83页，星期日，2025年，2月5日技巧三：常见故障及解决时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工程师便可解决如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关第46页，共83页，星期日，2025年，2月5日技巧四：检测指标检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大）灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可使检测结果更为明了合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的