甾体激素类药物分析.ppt

**********************************比色法（续）(3)、水分、温度、光线和氧的影响：当溶剂中含水量增高时，吸收度随之降低。因为甾体激素与异烟肼的缩合为可逆反应，水分可促使反应逆转而水解。温度升高，反应加速。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发及吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。(4)、反应的专属性：本法对?4—3—酮甾体具有一定的专属性。第62页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）具有?4—3—酮基的甾体激素，在室温不到lh即可定量地与酸性异烟肼反应；其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，例如C20—酮化合物(黄体酮，可的松等)反应就很慢。C17—酮化合物也可发生反应并形成腙，Cll—酮在上述条件下不发生反应。具有共扼双键的另一些甾酮化合物，如?5—7—酮醋酸胆甾醇，在相当长的时间内反应仍不能完全。因此，在上述反应条件下，本法对?4—3—酮甾体具有一定的专属性。第63页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(1)、氯化三苯四氮唑（TTC）氯化三苯四氮唑即为2,3,5—三苯基氯化四氮唑（2,3,5—triphenyltetrazoliumchloride,i.e.TTC），为无色试剂，其结构为：(二)四氮唑比色法1、四氮唑盐的种类第64页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(2)、蓝四氮唑（Bluetetrazoline,i.e.BT）BT的化学名为3,3’—二甲氧苯基—双—4,4’—（3,5—二苯基）氯化四氮唑。该试剂为无色,其结构为：第65页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）四氮唑比色法是测量皮质激素的重要方法。基于C17-?-醇酮基（-CO-CH2OH）的还原性，在强碱性溶液中被TTC或BT氧化，而TTC或BT被还原为有色的甲（formazan）衍生物，其颜色随条件不同而产生差异，多为红色或蓝色。2、反应原理第66页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）第67页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）USP（23）采用蓝四氮唑，BP（1993）采用氯化三苯四氮唑，中国药典（2000）采用氯化三苯四氮唑。氯化三苯四氮唑的还原产物为深红色的三苯甲，故称为红四氮唑（redtetrazoline，即RT），其?max为480~490nm，多数为485nm。蓝四氮唑的还原产物为暗蓝色的双甲，?max约为525nm。但是，按照美国药典规定的实验条件，几乎是定量形成BT单甲（红色），若将反应混合物加热，将生成BT双甲臢（蓝色）。3、测定方法第68页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(1)、基团影响一般认为，C11—酮基的反应速度快于C11—羟基甾体；C21—羟基酯化后较其母体羟基的反应速度慢；当酯化了的基团为三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯时，反应更慢。4、讨论(2)、溶剂和水分的影响含水量大时会使呈色速度减慢，则反应可采用无水乙醇。在含水量不超过5％时，对结果几乎无影响，因此也可采用95％乙醇。而醛具一定还原性，会使吸收度增高，故一般应采用无醛醇作溶剂。第69页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(3)、碱的种类及加入顺序的影响常采用的碱为氢氧化四甲基铵,且以先加四氮唑盐溶液再加碱液较好。有研究表明:当皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间(24h)接触后，皮质激素有部分分解。(4)、空气中氧及光线的影响反应及其产物对光敏感，因此必须用避光容器并置于暗处显色，同时在达到最大呈色时间后，立即测定吸收度。TTC法形成的甲对空气中氧敏感，明显影响颜色强度和稳定性，因此BP(1993)规定在加入试剂后要往容器中充氮气。第70页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(5)、温度与时间的影响一般说来，呈色速度随温度增高而加快。一般以室温或30℃恒温条件下显色，易得重现性较好的结果。中国药典多数在25℃暗处反应40—45mm。第71页，共73页，星期日，2025年，2月5日比色法（续）(三)Kober反应比色法1、原理Kober反应比色法是指雌激素与硫酸—乙醇反应呈色,基于产物在515nm附近的最大吸收进行比色法测定。其反应原理为:第72页，共73页，星期日，2025年，2月5日感谢大家观看第73页，