细胞凋亡实验.ppt

关于细胞凋亡实验第1页，共27页，星期日，2025年，2月5日凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。坏死（Necrosis）：各种致病因子，干扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成细胞的意外死亡。一、细胞的死亡方式第2页，共27页，星期日，2025年，2月5日二、细胞坏死与凋亡的比较坏死凋亡性质病理性、非特异性生理性或病理性，特异性诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗能DNA电泳形态变化弥散性降解，电泳呈均一DNA片状细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀DNA片段化（180—200bp），电泳呈“梯”状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应凋亡小体无有基因调控无有第3页，共27页，星期日，2025年，2月5日三、细胞凋亡的生理意义1.确保正常发育、生长如：指（趾）间隙的形成2.维持内环境稳定如：清除受损、突变或衰老的细胞3.发挥防御功能如：使受到病毒感染的细胞凋亡第4页，共27页，星期日，2025年，2月5日细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化凋亡小体初期：核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小中期：胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割后期：邻近的上皮细胞、MΦ、瘤细胞等吞噬凋亡小体四、凋亡时细胞的主要变化

（一）形态学改变第5页，共27页，星期日，2025年，2月5日NormalCellApoptoticcell第6页，共27页，星期日，2025年，2月5日（二）、生化改变１、DNA片段化－主要特征2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活第7页，共27页，星期日，2025年，2月5日内源性核酸内切酶的作用H1核心颗粒连接区180-200bp内源性核酸内切酶Zn2+Ca2+Mg2+第8页，共27页，星期日，2025年，2月5日五、细胞凋亡的检测方法

1、形态学检测（一）HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状）（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察第9页，共27页，星期日，2025年，2月5日透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。第10页，共27页，星期日，2025年，2月5日荧光显微镜

?Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）第11页，共27页，星期日，2025年，2月5日2、DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成第12页，共27页，星期日，2025年，2月5日第13页，共27页，星期日，2025年，2月5日3、流式细胞仪检测flowcytometer（一）PI单染（二）Annexinⅴ/PI双染色第14页，共27页，星期日，2025年，2月5日（一）PI单染

荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性