连接酶及其他二.ppt

?逆转录酶三、特性AMV逆转录酶的活性其次表现为RNaseH活性。此酶可以特异性降解RNA-DNA杂种双链中的RNA部分。另外，还具有DNA内切酶活性和核酸结合活性。74第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日?逆转录酶四、用途逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝,然后构建克隆,大量扩增,并表达这种基因,从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。75第32页，共47页，星期日，2025年，2月5日一、性质末端转移酶催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端。这很像DNA聚合酶通过5′3′聚合5′-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链。所不同的是末端转移酶不需要模板。第四节末端转移酶76第33页，共47页，星期日，2025年，2月5日关于连接酶及其他二第1页，共47页，星期日，2025年，2月5日2.修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键一、DNA连接酶的基本性质44第2页，共47页，星期日，2025年，2月5日一、DNA连接酶的基本性质3.连接多个平头双链DNA分子：第3页，共47页，星期日，2025年，2月5日注意：（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切口（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；46第4页，共47页，星期日，2025年，2月5日（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47第5页，共47页，星期日，2025年，2月5日T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶二、DNA连接酶的种类第6页，共47页，星期日，2025年，2月5日?T4噬菌体DNA连接酶该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切口的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切口该酶可连接49第7页，共47页，星期日，2025年，2月5日第8页，共47页，星期日，2025年，2月5日?大肠杆菌DNA连接酶该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。具有同源互补粘性末端的不同DNA分子一条带有切口的双链DNA分子该酶可连接但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接第9页，共47页，星期日，2025年，2月5日T4噬菌体DNA连接酶该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端).两种酶各自的优点大肠杆菌DNA连接酶:该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-----互补粘性末端).52第10页，共47页，星期日，2025年，2月5日?T4噬菌体RNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶由T4噬菌体基因63编码,需要ATP作为辅助因子.连接反应:主要用途:对RNA进行3′末端标记,即将32P标记的3′,5′-二磷酸单核苷加到RNA的3′端.该酶可催化单链DNA或RNA的5′磷酸与相邻的3′羟基、单核苷酸共价连接.53第11页，共47页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶一、DNA聚合酶的分类根据DNA聚合酶所使用模板的不同,可分为:依赖于DNA的DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段酶T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶55第12页，共47页，星期日，2025年，2月5日?大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1.DNA聚合酶的分类目前,从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶,分别为:DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ:与DNA复制有关主要参与DNA的修复分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ第13页，共47页，星期日，2025年，2月5日2.大肠杆菌DNA