《细胞代谢实验》课件.pptVIP

**************************常见细胞代谢实验方法1细胞活性检测MTT法、CCK-8法等。2ATP含量检测荧光素酶法、化学发光法等。3乳酸脱氢酶活性检测酶联免疫吸附试验（ELISA）等。4谷氨酰胺合成酶活性检测分光光度法等。呼吸链复合物活性测定呼吸链复合物是线粒体内膜上的蛋白质复合物，参与氧化磷酸化过程。呼吸链复合物活性测定可以反映线粒体的功能状态。常用的测定方法包括：分光光度法：测定特定底物的氧化速率。电化学方法：测定电子传递速率。ATP含量检测荧光素酶法ATP与荧光素酶反应，产生荧光，荧光强度与ATP含量成正比。化学发光法ATP与鲁米诺反应，产生化学发光，化学发光强度与ATP含量成正比。乳酸脱氢酶活性检测1酶联免疫吸附试验（ELISA）利用特异性抗体，检测乳酸脱氢酶的含量。2分光光度法测定乳酸脱氢酶催化反应的速率。谷氨酰胺合成酶活性检测分光光度法测定谷氨酰胺合成酶催化反应的速率。HPLC法利用高效液相色谱法，分离和定量谷氨酰胺。细胞呼吸作用测定1氧电极法利用氧电极，测定细胞呼吸过程中氧气的消耗速率。2Seahorse生物分析仪利用Seahorse生物分析仪，同时测定细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。酶促反应动力学分析酶促反应动力学分析是研究酶催化反应速率与底物浓度、酶浓度等因素之间关系的方法。通过酶促反应动力学分析，可以了解酶的催化机制、底物结合特性和酶的活性调控方式。常用的分析方法包括：米氏方程分析Lineweaver-Burk作图线粒体膜电位检测荧光探针法利用荧光探针，根据荧光强度的变化，反映线粒体膜电位的变化。1流式细胞术利用流式细胞术，检测细胞群体的线粒体膜电位。2氧化应激指标测定ROS水平检测检测细胞内活性氧（ROS）的水平。谷胱甘肽水平测定检测细胞内谷胱甘肽（GSH）的水平。MDA水平测定检测细胞内丙二醛（MDA）的水平。ROS水平检测荧光探针法利用荧光探针，根据荧光强度的变化，反映ROS的水平。流式细胞术利用流式细胞术，检测细胞群体的ROS水平。谷胱甘肽水平测定1DTNB法利用DTNB（5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸））与GSH反应，产生黄色化合物，测定其吸光度。2HPLC法利用高效液相色谱法，分离和定量GSH。细胞内Ca2+浓度测定荧光探针法利用荧光探针，根据荧光强度的变化，反映细胞内Ca2+浓度的变化。1流式细胞术利用流式细胞术，检测细胞群体的细胞内Ca2+浓度。2细胞膜通透性检测台盼蓝染色台盼蓝是一种染料，正常细胞膜具有选择通透性，可以阻止台盼蓝进入细胞，而细胞膜受损的细胞则可以被台盼蓝染色。乳酸脱氢酶释放细胞膜受损的细胞会释放乳酸脱氢酶（LDH），通过检测培养基中LDH的活性，可以反映细胞膜的通透性。细胞凋亡分析AnnexinV-FITC/PI染色AnnexinV可以结合到凋亡细胞膜表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS），PI可以结合到细胞膜受损的细胞的DNA。通过AnnexinV-FITC/PI染色，可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。TUNEL染色TUNEL（原位末端转移酶标记）染色可以检测凋亡细胞的DNA断裂。细胞增殖测定1BrdU掺入BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶类似物，可以掺入到正在复制的DNA中。通过检测BrdU的掺入量，可以反映细胞的增殖活性。2CFSE染色CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）可以标记细胞，随着细胞分裂，CFSE的荧光强度逐渐降低。通过检测CFSE的荧光强度，可以反映细胞的增殖代数。细胞周期分析PI染色PI（碘化丙啶）可以结合到DNA，根据PI的荧光强度，可以区分不同细胞周期的细胞。1流式细胞术利用流式细胞术，检测细胞群体的细胞周期分布。2基因表达profilingmicroarray芯片利用基因芯片，可以同时检测成千上万个基因的表达水平。RNA-seq测序利用RNA测序技术，可以全面地检测细胞的转录组。代谢组学分析1气相色谱-质谱联用（GC-MS）利用GC-MS，可以分离和鉴定挥发性小分子代谢物。2液相色谱-质谱联用（LC-MS）利用LC-MS，可以分离和鉴定非挥发性小分子代谢物。蛋白质组学分析1双向电泳利用双向电泳，可以分离细胞内的蛋白质。2质谱分析利用质谱分析，可以鉴定分离的蛋白质。实验中的注意事项1无菌操作所有操作均需在超净工作台中进行，防止细菌污染。2准确量取使用精确的移液枪，确保加入的试剂量准确。3记录数