酶的改造方法进展.ppt

易错PCR方法第29页，共64页，星期日，2025年，2月5日有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)第30页，共64页，星期日，2025年，2月5日有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold)第31页，共64页，星期日，2025年，2月5日有性进化:交错延伸法（1997，Arnold)第32页，共64页，星期日，2025年，2月5日基因家族的同源重组无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变有性进化方法1）DNA改组法（DNAShuffling)2）体外随机重组法（RPR)3）交错延伸法(StEP)基因家族的同源重组外显子的改组杂合进化第33页，共64页，星期日，2025年，2月5日基因突变库的筛选方法目标根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需的突变基因。难点突变库容量大，一般达到106，工作量巨大关键高通量筛选：通量大，效率高方法平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法第34页，共64页，星期日，2025年，2月5日平板筛选方法依据细胞生长情况筛选热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pH稳定性：pH梯度极端环境：高盐、低温、高浓毒物质第35页，共64页，星期日，2025年，2月5日平板筛选方法依据颜色变化筛选大肠杆菌?-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色）反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚脂肪酶筛选海因酶筛选第36页，共64页，星期日，2025年，2月5日平板筛选方法依据透明圈大小筛选淀粉酶的进化：淀粉平板培养基豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基第37页，共64页，星期日，2025年，2月5日荧光筛选方法利用自身荧光激发特性生成产物本身是具有荧光激发特性的物质利用荧光报告基因辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因：原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖第38页，共64页，星期日，2025年，2月5日绿色荧光蛋白的应用分子标记：FISH分析菌株（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M.trichosporiumOB3b第39页，共64页，星期日，2025年，2月5日噬菌体显示筛选模式第40页，共64页，星期日，2025年，2月5日噬菌体显示的几种类型第41页，共64页，星期日，2025年，2月5日核糖体显示技术第42页，共64页，星期日，2025年，2月5日RNA-蛋白质融合技术第43页，共64页，星期日，2025年，2月5日RNA-蛋白质的融合第44页，共64页，星期日，2025年，2月5日酶定向进化的发展趋势定向进化方法发展迅猛方法均有知识产权；方法更有针对性和特征性；高通量筛选方法是关键新方法（荧光显示/表面展示）在涌现，技术交叉是趋势；定向进化是近20年中最成功的酶改造方法新的实例越来越多；第45页，共64页，星期日，2025年，2月5日关于酶的改造方法进展第1页，共64页，星期日，2025年，2月5日为什么要进行酶改造？温和的自然体系：常温、常压、中性pH、水环境极端的工业体系：高温、高压、酸、碱、有机溶剂酶不适应第2页，共64页，星期日，2025年，2月5日酶的改造方法酶的化学修饰-分子修饰酶的物理修饰-固定化酶的生物改造-定向进化酶的人工模拟-抗体酶第3页，共64页，星期日，2025年，2月5日一、酶的化学修饰B通过制备酶单分子纳米凝胶，大大提高了酶的稳定性第4页，共64页，星期日，2025年，2月5日酶分子修饰主要方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰第5页，共64页，星期日，2025年，2月5日1）金属离子置换修饰实例SOD的金属离子置换：天然SOD中的铁原子被锰原子取代后，重组酶对H2O2的稳定性显著增强，对NaH3的抑制作用的敏感型显著降低。氨基酸酰化酶的金属离子置换：氨基酰化酶的锌被钴取代后，底物专一性和最适pH都有改变，锌酶对N-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5,而钴酶是7.0.第6页，共64页，星期日，2025年，2月5日2）酶大分子修饰的实例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐结合，酶的催化效率提高2.25倍；用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠