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人类融合基因P210RNA扩增检测试剂盒（数字?PCR法）

主要原材料研究资料

主要原材料研究资料

提交申报产品主要原材料的研究资料，内容包括主要原材料的来源、选择、制备方法的研究资料及其质量标准的制订资料、评价结果和质量分析证书，并详细描述原材料的技术指标和验收标准。

一、概述

白血病是我国十大高发恶性肿瘤之一，近年的临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在染色体畸变，如易位、缺失和突变等。染色体易位畸变大部分情况下会形成相关的融合基因，是白血病和淋巴瘤临床诊断的重要指标之一。

由t(9；22)(q34；q11)产生的费城染色体(Ph)在血液肿瘤中具有重要的诊断和预后意义，出现于90%以上的CML、30%成人ALL、2%~20%儿童ALL以及少数AML和MM患者。位于9q34的ABL基因与位于22q11的BCR基因相互易位产生的BCR-ABL融合基因会编码一种癌蛋白(p210BCR-ABL)，95%的CML患者表现为P210阳性，在ph阳性ALL中，P210约占1/3，因此融合基因BCR-ABL的亚型P210可作为白血病分型诊断、疗效评价以及治疗监测的可靠指标。

本报告主要是关于人类BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）主要原材料的研究，包括该试剂盒的相关信息以及主要原料的性状、性能等的研究。

二、人类?BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）检测原理及相关信息

2.1检测原理

使用随机引物反转录结合液滴数字PCR（ddPCR）技术进行定量检测。e13a2（b2a2）和e14a2（b3a2）BCR-ABL易位同时扩增、检测和量化。样本为人类血液中提取的总RNA，对FAM通道中的两个BCR-ABL融合转录本e13a2（b2a2）和/或e14a2（b3a2）的副本进行定量检测，并以ABL转录本内源性对照进行定量。将BCR-ABL转录本的数量量化为BCR-ABL/ABL的比率，然后返回国际范围内的值。

2.2人类?BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）?产品信息

包装规格：48人份/盒。

储存条件：-20℃条件下避光保存，有效期12个月。拆封后未使用完的试剂请立即-20℃条件下避光保存，并在8周内使用完且反复冻融次数不超过8次。

2.3人类?BCR/ABL融合基因P210RNA扩增检测试剂盒(数字PCR法）?组分

三、主要原料来源及制备方法

3.1RNasin：将转染有包含RNasin表达基因的BL21(DE3)大肠杆菌于LB培养基中进行诱导表达；然后将大肠杆菌裂解产物用RNaseA亲和层析进行纯化制得。

3.2逆转录酶（c-MMLV酶）：将逆转录酶基因插入至载体pET28a上，产生pET28a-MMLVRT质粒，具体合成序列包括3’端添加的纯化标签6×His序列和TAA终止密码子。将此质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达宿主构建，该质粒诱导表达后产生C端融合6×His纯化标签的MMLV逆转录酶。取发酵菌体以Ni亲和层析柱结合缓冲液重悬后，以细胞高压匀浆破碎仪破碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到MMLV逆转录酶突变体，配制于存储缓冲液中，低温保存。

3.3热启动TaqDNA聚合酶：

根据GenBank公布的TaqDNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的TaqDNA聚合酶基因片段；然后将优化的TaqDNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达TaqDNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成TaqDNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体与TaqDNA聚合酶进行特异性结合，完成TaqDNA聚合酶的配基修饰，即为热启动TaqDNA聚合酶。

3.4DNA引物和探针：使用****核酸分析软件分别对已知的融合基因BCR-ABL(P210）基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找到同源区段的基础上，进一步使用****引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于BCR-ABL(P210）基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了融合基因BCR-ABL(P210）检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法（FPLC）纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团（报告基团）的6-FAMamidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上