人体益生菌阿克曼氏菌检测方法的开发 (1).docVIP

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2025-03-04 发布于云南
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人体益生菌阿克曼氏菌检测方法的开发 (1).doc

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摘要

人体内的肠道微生物群在维持生理稳态中一直发挥着重要作用，为人类健康提供内部支持。其中目前对肠道微生物的检测手段除了有传统培养法、下一代测序技术（NGS）两种以外。目前，这些研究方法中普遍存在着一些明显的缺陷，如操作步骤繁多、耗费时间长、准确率低下、研究成本高等问题。除了以上两种，还有荧光原位杂交（FISH）和实时荧光定量PCR两种方法。本文旨在开发出一种利用实时荧光定量PCR来定向检测阿克曼氏菌的方法，通过该方法可以快速高效地在低成本的条件下定向检测阿克曼氏菌的数量并加以分析，由此为阿克曼氏菌的深入研究提供更加高效的大量数据支持。

为了设计出特异性强，灵敏度高的引物探针组合，先从NCBI数据库中检索阿克曼氏菌的全基因组数据。找到16SrRNA序列保守区，通过MEGA软件先将序列进行对齐，根据阿克曼氏菌的特征SNP位点设计特异性强的引物探针组合，然后送到上海生工进行合成。本实验所检测的是人肠道微生物阿克曼氏菌，样本均为人粪便样本，能更好的反映人的肠道微生物组成。通过粪便微生物DNA提取试剂盒QIAampPowerFecalProDNAKit进行微生物基因组DNA提取，使用过验证合格的引物先进行普通PCR扩增检测，琼脂糖凝胶电泳验证后再用qPCR检测手段去验证是否符合实验要求。

在HITdb数据库中选择目标菌种后，我们设计了具有特异性的引物和探针，并验证了靶向菌种的覆盖率超过70%。通过比较文献数据和实验验证，筛选出适用于TaqManqPCR的肠道微生物标记基因，建立标准曲线，实现对肠道微生物数量的快速定量。通过对不同样本的检测和比较，我们获得了检测结果的变异系数小于10%的证明，说明该方法具有很高的稳定性。我们将TaqManqPCR方法检测结果与16srRNA测序结果进行了相关性分析，结果较为显著（p0.05），验证了该方法的有效性。本研究根据HITdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16SrRNA测序结果相吻合。该研究可以为各种微生物行业提供更高的效益，同时也为临床诊断制定治疗方案提供了快速有效的参考信息。

关键词：肠道微生物群；阿克曼氏菌；琼脂糖凝胶电泳；实时荧光定量PCR

Abstract

Theintestinalmicrobiotainthehumanbodyplaysanimportantroleinmaintainingphysiologicalhomeostasisandprovidinginternalsupportforhumanhealth.Currently,therearetwocommonlyusedmethodsfordetectingintestinalmicrobiota:traditionalcultivationandnext-generationsequencing(NGS).However,thesemethodshavesomeobviousdefects,suchascomplexoperationsteps,longtimeconsumption,lowaccuracy,andhighresearchcosts.Inadditiontothesetwomethods,therearetwoothermethods:fluorescenceinsituhybridization(FISH)andreal-timefluorescencequantitativePCR.ThisarticleaimstodevelopamethodfortargeteddetectionofAkkermansiamuciniphilausingreal-timefluorescencequantitativePCR,whichcanquicklyandefficientlydetectandanalyzethenumberofAkkermansiamuciniphilaunderlow-costconditions.Thisprovidesmoreefficientandmassivedatasupportforthein-depthstudyofAkkermansiamuciniphila.

Inordertodesignaprimerprobecombinationwithhighspecificityandsensitivity,the