DB22T 3283-2021 猪血凝性脑脊髓炎病毒检测 TaqMan荧光定量PCR法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

DB22

吉林省地方标准DB22/T3283—2021

猪血凝性脑脊髓炎病毒检测TaqMan荧光定量PCR法

TaqManquantitativePCRassayfordetectionofporcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus

2021-11-26发布2021-12-15实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T3283—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的

规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本文件起草单位：吉林大学。

本文件主要起草人：贺文琦、李姿、兰云刚、赵魁、关继羽、陆慧君、高丰。

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DB22/T3283—2021

猪血凝性脑脊髓炎病毒检测TaqMan荧光定量PCR法

1范围

本文件描述了猪血凝性脑脊髓炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。

本文件适用于猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

猪血凝性脑脊髓炎病毒porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus，PHEV

引起猪血凝性脑脊髓炎的病原。PHEV为不分段的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）、β冠状病毒属（Betacoronavirus）成员。

4原理

根据PHEVS基因序列设计引物和探针，探针在5’端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端标记TAMRA作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。

5试验条件

5.1生物安全要求

所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489规定。5.2防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27401规定。

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DB22/T3283—2021

6试剂或材料

6.1M-MLV反转录酶，浓度为200U/μL，-20℃保存。6.2TaqDNA聚合酶，-20℃保存。

6.3RNase抑制剂，浓度为40U/μL，-20℃保存。

6.4Oligo（dT）18引物，浓度为50U/μL，-20℃保存。6.5dNTP混合物，浓度为2.5mmol/L，-20℃保存。

6.6氯仿，常温保存。

6.7异丙醇，常温保存。

6.875%乙醇，常温保存，使用前-20℃预冷。6.9TRIzol裂解液，常温或4℃保存。

6.105×MLV缓冲液-20℃保存。

6.1110×PCR缓冲液-20℃保存。

6.12阳性对照样品，灭活PHEV的细胞培养物，Ct值≤30。

6.13阴性对照样品，正常小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a细胞）、猪肾细胞（PK-15细胞）等，或者经检测不含PHEV的健康猪脑、脊髓组织研磨液。

6.14引物和探针见表1。引物浓度均为10mmol/L，-20℃避光保存，6个月内使用。

表1引物和探针序列信息

名称

序列（5’-3’）

上游引物F

CCAGGATAAATTTCTGTGG

下游引物R

AACCAGGACTAACCTTTGC

TaqMan探针（FAM）

ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA）

7仪器设备

7.1冰箱，4℃冰箱、-20℃冰箱和-70