DB22T 3091-2019 鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法　　.docxVIP

ICS11.220B41

DB22

吉林省地方标准DB22/T3091—2019

鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

Real-timePCRmethodforthedetectionofTuberculosispathogenicorganismindeer

2019-12-25发布2020-02-01实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T3091—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。

本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。

1

DB22/T3091—2019

鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

实时荧光PCRReal-timePCR

一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号量到达设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）

5原理

以DNA为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测样品模板的初始浓度。

6试剂和材料

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DB22/T3091—20196.1试剂

除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。6.1.1实时荧光PCR扩增所用的引物序列见表1。

表1引物序列

类别

核酸序列（5’-3’）

结核分枝杆菌

上游引物5’-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3’

下游引物5’-AACGACTCCGCCCCAACTG-3’

探针5’-FAM-ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3’

牛分枝杆菌

上游引物5’-CGGGCGTTTTGTCGCATCC-3’

下游引物5’-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3’

探针5’-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA–TAMRA-3’

6.1.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。

6.1.3Taq酶。

6.1.4磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01mol/L,pH7.4)。

6.1.50.5mol/LEDTA(pH8.0)。6.2材料

6.2.1离心管（50mL、15mL、1.5mL）。

6.2.2吸头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。

6.2.3荧光定量PCR管。

7仪器设备

7.1电子天平，感量0.01g。7.2荧光定量PCR仪。

7.3台式低温高速离心机（4℃,13000r/min）。

7.4移液器（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。7.5恒温水浴锅。

8生物安全要求

采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按GB19489和GB/T27401的有关规定执行。

9操作步骤

9.1样品的采集和保存

9.1.1组织样品的采集和保存

采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于5g。做好标识，置于密闭容器