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猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

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猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

摘要：猪肺炎支原体（Mycoplasmalpneumoniaofpigs，MPP）是引起猪呼吸道疾病的重要病原之一。本研究旨在分析不同毒力猪肺炎支原体菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异及其作用机制。通过体外培养猪气管上皮3D细胞，分别感染不同毒力的猪肺炎支原体菌株，观察细胞形态学变化、细胞活力、炎症因子表达以及细胞凋亡情况。结果表明，不同毒力的猪肺炎支原体菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤程度存在显著差异，高毒力菌株引起的细胞损伤更为严重。进一步研究发现，高毒力菌株感染后，细胞内炎症因子表达升高，细胞凋亡增加，提示炎症反应和细胞凋亡可能是其损伤机制之一。本研究为猪肺炎支原体感染的治疗和防控提供了理论依据。关键词：猪肺炎支原体；毒力菌株；猪气管上皮3D细胞；损伤差异；炎症反应；细胞凋亡

前言：猪肺炎支原体（Mycoplasmalpneumoniaofpigs，MPP）是一种重要的猪呼吸道病原体，可引起猪只出现咳嗽、呼吸困难等症状，严重时可导致猪只死亡。近年来，随着养猪业的快速发展，猪肺炎支原体感染已成为猪呼吸道疾病综合症（PorcineRespiratoryDiseaseComplex，PRDC）的主要原因之一。猪肺炎支原体具有多种毒力菌株，不同毒力菌株感染后引起的临床症状和病理变化存在差异。本研究通过比较不同毒力猪肺炎支原体菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异，探讨其损伤机制，为猪肺炎支原体感染的治疗和防控提供理论依据。

一、材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括猪肺炎支原体（Mycoplasmalpneumoniaofpigs，MPP）菌株、猪气管上皮细胞系（Porcinetrachealepithelialcells，PTEC）、胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）、DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、无菌水、无菌滤膜、细胞培养箱、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪、实时荧光定量PCR仪、低温离心机、超净工作台等。实验所用的猪肺炎支原体菌株由我国某农业大学动物医学院兽医微生物实验室提供，经过鉴定为典型的高毒力菌株。猪气管上皮细胞系购自美国ATCC细胞库，经过实验室传代培养，保证细胞活力和纯度。所有实验材料均按照产品说明书进行操作。

(2)在细胞培养过程中，将猪气管上皮细胞系接种于直径为6cm的细胞培养皿中，放入细胞培养箱中培养，温度控制在37℃，CO2浓度为5%，相对湿度为95%。细胞培养至对数生长期，采用0.25%胰蛋白酶消化法进行传代。实验所用的胎牛血清和DMEM培养基均为高糖型，购自美国Gibco公司。为了保证实验结果的可靠性，所有实验均在超净工作台中进行，以避免污染。

(3)在感染实验中，将不同毒力的猪肺炎支原体菌株进行活化，调整菌液浓度至适宜范围。将活化的猪肺炎支原体菌株按照一定的感染复数（MOI）接种于培养好的猪气管上皮细胞中，置于细胞培养箱中培养。感染后，分别于感染后12、24、48、72小时观察细胞形态学变化，并收集细胞用于后续实验。所有实验均重复三次，以保证实验结果的可靠性。实验过程中，严格遵循无菌操作原则，确保实验结果的准确性。

1.2细胞培养与感染

(1)细胞培养采用猪气管上皮细胞系（PTEC），将其接种于含有10%胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM培养基中。细胞培养箱温度设定为37℃，CO2浓度为5%，湿度保持在95%。待细胞长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化并分瓶传代，确保细胞生长状态良好。

(2)在感染实验中，将不同毒力的猪肺炎支原体菌株分别活化，调整菌液浓度至1×10^6CFU/mL。将活化的菌液与等体积的细胞培养基混合，形成感染复数（MOI）为1的感染液。将感染液滴加至细胞培养皿中，使菌液覆盖细胞表面，于37℃、5%CO2条件下培养。

(3)感染后不同时间点（12、24、48、72小时）观察细胞形态学变化，并通过细胞计数、酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞活力。同时，收集细胞进行炎症因子表达、细胞凋亡等指标的检测，以评估不同毒力猪肺炎支原体菌株对猪气管上皮细胞的损伤程度。实验过程中，严格遵循无菌操作原则，确保实验结果的准确性。

1.3实验分组与处理

(1)实验分为四组，分别为对照组、低毒力菌株感染组、中毒力菌株感染组和高毒力菌株感染组。对照组细胞仅用细胞培养基处理，不进行感染。低毒力、中毒力