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4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

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4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

摘要：本文研究了副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中4个基因的DNA甲基化和mRNA表达情况。通过实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR技术，检测了基因的mRNA表达水平；通过亚硫酸氢钠处理和测序分析，检测了基因的DNA甲基化状态。结果表明，副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织后，4个基因的mRNA表达水平发生显著变化，且与DNA甲基化状态密切相关。本研究为进一步揭示副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织的分子机制提供了新的理论依据。

副猪嗜血杆菌是一种常见的猪源细菌，可引起仔猪多系统疾病，严重影响猪只的生长发育和养殖业的健康发展。近年来，副猪嗜血杆菌感染引起的仔猪脑炎已成为猪病研究的热点。本研究旨在探讨副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中基因的DNA甲基化和mRNA表达情况，以期为揭示副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织的分子机制提供理论依据。

一、材料与方法

1.实验动物与分组

(1)实验动物选用健康仔猪30头，体重约为20kg，雌雄各半，随机分为对照组和感染组，每组15头。对照组仔猪在正常饲养条件下饲养，感染组仔猪通过肌肉注射副猪嗜血杆菌活菌悬液进行感染，剂量为每头仔猪1×10^9CFU。注射后，两组仔猪均在相同的环境条件下饲养，观察记录仔猪的临床症状和生长情况。

(2)感染后第3天，观察发现感染组仔猪出现不同程度的发热、食欲不振、精神萎靡等症状，对照组仔猪无异常。在第5天，对感染组仔猪进行脑组织采集，对照组仔猪同时进行脑组织采集作为对照。共采集30份脑组织样本，其中感染组15份，对照组15份。

(3)将采集到的脑组织样本进行称重，平均重量为20g。将脑组织样本分为两组，一组用于mRNA表达水平检测，另一组用于DNA甲基化状态检测。mRNA表达水平检测采用实时荧光定量PCR技术，DNA甲基化状态检测采用亚硫酸氢钠处理和测序分析技术。实验过程中，严格控制操作步骤，确保实验结果的准确性。

2.样品采集与处理

(1)样品采集：在感染组和对照组仔猪的脑组织中采集样本。具体操作如下：在无菌条件下，使用手术刀在仔猪脑部中线位置切开皮肤，暴露出颅骨，用脑组织活检钳取出脑组织。将采集到的脑组织样本分为两份，一份用于mRNA表达水平检测，另一份用于DNA甲基化状态检测。

(2)mRNA表达水平检测：首先，将脑组织样本置于液氮中冷冻，以保持样本的稳定性。然后，将冷冻的脑组织样本转移到-80℃冰箱中保存备用。在进行mRNA表达水平检测前，将脑组织样本解冻，按照试剂盒说明书进行总RNA提取。提取的总RNA通过NanoDrop?2000分光光度计检测其浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。随后，按照试剂盒说明进行cDNA合成，并使用实时荧光定量PCR技术检测目标基因的mRNA表达水平。实验设置三个复孔，重复三次，以确保结果的可靠性。

(3)DNA甲基化状态检测：在提取总RNA的同时，对脑组织样本进行DNA提取。DNA提取过程按照试剂盒说明书进行，提取的DNA通过NanoDrop?2000分光光度计检测其浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。随后，对提取的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以转化胞嘧啶为尿嘧啶，从而检测DNA甲基化状态。处理后的DNA通过PCR扩增目标基因的特定区域，并使用甲基化特异性PCR技术检测甲基化程度。实验设置三个复孔，重复三次，以确保结果的可靠性。最后，将扩增产物进行测序分析，以确定基因的甲基化状态。

3.mRNA表达水平检测

(1)实验材料：选取感染组和对照组仔猪的脑组织样本，共30份。使用实时荧光定量PCR技术检测目标基因的mRNA表达水平。实验前，对提取的总RNA进行浓度和纯度检测，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。实验中，选取了4个与副猪嗜血杆菌感染相关的基因作为研究对象，包括基因A、基因B、基因C和基因D。

(2)实验步骤：首先，根据基因序列设计特异性引物，引物序列经过优化以确保扩增效率。然后，将提取的总RNA进行cDNA合成，反应体系包括逆转录酶、dNTPs、随机引物和RNA酶抑制剂等。cDNA合成完成后，进行实时荧光定量PCR反应，反应体系包括cDNA模板、引物、荧光染料和PCR试剂等。实验设置三个复孔，重复三次，以确保结果的可靠性。实时荧光定量PCR仪器使用ABI7500Real-TimePCRSystem，每个样本均进行标准曲线的绘制，以确定模板拷贝数与