2024-2025学年高二生物人教版选择性必修3 第3章 实验突破二 DNA片段的扩增及电泳鉴定.docx

一、DNA片段的扩增

1．实验原理

2．实验步骤

二、PCR扩增产物的电泳鉴定

1．实验原理

2．实验步骤

三、操作提示

1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

四、关键点拨

1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G、C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。

2．未出现扩增条带的主要原因

(1)TaqDNA聚合酶失活。

(2)引物出现质量问题。

(3)Mg2＋浓度过低。

(4)变性时的温度低，变性时间短。

3．出现非特异性扩增条带的主要原因

(1)模板DNA出现污染。

(2)引物特异性不强或形成引物二聚体。

(3)Mg2＋浓度过高。

(4)复性时的温度过低等。

例1(2023·沧州高二月考)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是()

A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度

B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用

C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理

D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出

答案A

解析PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌处理，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1mm为宜，D错误。

例2用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为无菌蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是()

A．PCR产物的分子大小在250～500bp之间

B．3号样品为不含目的基因的载体DNA

C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D．10号确定反应体系等对结果没有干扰

答案B

解析PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A合理；3号PCR结果包含250～500bp片段，应包含目的基因，B不合理；9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。

1．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是()

A．在进行操作时，一定要戴好一次性手套

B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20℃储存

C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化

D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换

答案C

解析将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在冰块上缓慢融化，C错误。

2．(2023·盐城高二期中)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是()

A．增加模板DNA的量

B．延长热变性的时间

C．延长延伸的时间

D．提高复性的温度

答案D

解析增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。

3．下列有关电泳的叙述，不正确的是()

A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率

C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动

D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定

答案C

解析由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错