肿瘤细胞培养和杂交瘤技术.ppt

4）去除和洗涤培养液，加入生长培养基（EMEM，15%FCS）培养48小时后，加入G418200ug/ml。5）更换培养基，含G418浓度可降低或不变，鉴定耐受集落生长，直到大多数细胞死亡。6）可利用克隆环，挑选集落，用trypsin消化单个集落，继续培养，直到细胞继续生长。7）尽早冻存细胞，传代中多次冻存。8）持续传代细胞，直到细胞死亡，不能再传代。第62页，共120页，星期日，2025年，2月5日结果可建立永久传代的恶性转化细胞系。但有可能用此方法建立的转化细胞系不一定具有恶性特征，可能与所转染细胞的基因稳定有关。第63页，共120页，星期日，2025年，2月5日【注意事项】

永久细胞系的建立，细胞具有过度生长的“危相”，大多数细胞死亡，仅少数集落出现。通过及时换液，保持培养液pH恒定和补充营养。第64页，共120页，星期日，2025年，2月5日（2）转染端粒酶基因，可诱导转化细胞系的建立：端粒酶在细胞内表达，抵消细胞分裂所致端粒缩短，是癌细胞获得不死性的重要分子机制。转染外源端粒酶基因于有限期传代的正常细胞系，包括人上皮细胞和成纤维细胞、血管内皮细胞等，均可诱导产生永久性细胞系，并证明了转染细胞中，端粒酶表达和端粒缩短受到了控制。第65页，共120页，星期日，2025年，2月5日最近有报告证明了用猿SV40病毒基因和人端粒逆转录酶基因（HTERTgene）两种转化方法转染人的上皮细胞，均可获得不死性细胞系，在转化细胞内可检测到端粒酶活性和控制了端粒缩短。第66页，共120页，星期日，2025年，2月5日SV40诱导的不死性细胞，伴有细胞不正常分化和核型不稳定，表现出对动物一定程度的致瘤性。而端粒酶传染的细胞很少有核型的改变和上皮细胞分化的特点，保持更多正常细胞的表型。说明用SV40LT抗原基因和HTERTgene转化细胞存在一定差异，SV40LT多引起细胞恶性转化，而HTERTgene主要诱导细胞获得不死性。第67页，共120页，星期日，2025年，2月5日（3）转基因小鼠：利用转基因小鼠可以建立转化细胞系，基本方法是设计有某种基因突变、缺失、嵌入病毒基因的DNA，植入小鼠的卵母细胞。发育的转基因小鼠将携带有表达某种基因的组织，从小鼠组织取材，可以获得转化细胞系。例如H2kbtsA58转基因小鼠，含有SV40LT抗原，从小鼠各种组织取材，可以建立多种永久转化细胞系。因此，利用转基因小鼠是建立细胞系快速有效的方法。第68页，共120页，星期日，2025年，2月5日（4）EB病毒感染B细胞建立转化细胞系EB病毒感染人外周血B淋巴细胞后，B细胞便能够被转化，并在体外继代生长，建立细胞系，长期储存的液氮，解决研究中大量细胞的来源。第69页，共120页，星期日，2025年，2月5日材料和方法：取健康人外周血5ml，加肝素（10u/ml）抗凝常规免疫方法分离淋巴细胞，用RPMI-1640含10%新生牛血清培养液，洗涤一次1000rpm10min离心，沉淀细胞悬浮于RPMI-164020%胎牛血清调整细胞浓度。第70页，共120页，星期日，2025年，2月5日EB病毒标准株B95-8细胞系可产生高浓度EB病毒上清（5×105/ml），用0.22um微孔滤膜过滤获细胞培养上清分装储存备用。第71页，共120页，星期日，2025年，2月5日淋巴细胞特征：取淋巴细胞悬液1ml，EB病毒1ml加至培养瓶混匀，37℃1h，吸附后，加入3~4ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃5%CO2孵育3~5天后用倒镜观察淋巴细胞程度，补加培养液当细胞浓度达1×106/ml，离心收集悬浮细胞，冻存液氮，同时采用合成黄染检测细胞活性，以细胞存率来评估细胞冻存前后的活性，一般冻存前的细胞活性约95%，冻存后为90%。第72页，共120页，星期日，2025年，2月5日在转化过程中，淋巴细胞的浓度（2×105/ml）和EB病毒的滴度、用量、新鲜程度-70℃储存9个月内EB病毒1ml均对淋巴细胞的转化为适合，转化成功率达85~100%。但在EB病毒转化B细胞的同时，又能刺激T细胞亚群的活性，细胞毒T细胞作用B细胞使转化失败，克服这一作用可通过控制淋巴细胞接种密度和加入环胞素A来消除毒性T细胞作用。（参考郑从义等报导）第73页，共120页，星期日，2025年，2月5日四、癌细胞系和转化细胞系

注意事项第74页，共120页，星期日，2025年，2月5日针对癌细胞建系存在的问题，进行细胞培养技术的改进，包括：①采用无血清或低血清培养基，可以抑制成纤维细胞的生长和降低其对癌胞生长不利的影响。同时补充癌细胞生长必要的成分。如上皮生长因子、转铁蛋白、