流式细胞术的原理和临床.ppt

培养的细胞中死细胞比活细胞的自发荧光要强，在某些细胞样品如脾和骨髓中，除了含有淋巴细胞和其他低自发荧光的细胞外还可能会有一些占不同比例的亮细胞，它们会干扰用免疫荧光方法本应能检测出来的稀有的、细胞数目较少的亚群。第30页，共58页，星期日，2025年，2月5日为减少自发荧光，应选用较亮的荧光染料，还应使用与荧光发射光谱相匹配的光学品质优良的滤片系统。利用较长波长的光线，如染料激光器的激光做为激发光源，也可减弱自发荧光。最后，对自发荧光还可用电子线路补偿的方法将自发荧光补偿掉。第31页，共58页，星期日，2025年，2月5日

细胞群体的DNA直方图流式细胞计测量的结果可为一数字矩阵，此矩阵可用一个或数个图形来表示。下面我们讨论一下，一个细胞群体的DNA直方图的图形。第32页，共58页，星期日，2025年，2月5日设一个指数生长的细胞群体全部细胞都处于增殖状态，用细胞动力学的语言说，就是增殖比是1。细胞群体经染色后,由于每个细胞结合的染料与DNA含量成正比。由于G1期细胞的DNA含量为2C，G2和M期细胞DNA含量为4C，S期细胞的DNA含量在2C—4C之间。第33页，共58页，星期日，2025年，2月5日于是，从理论上说，这样一个群体的DNA直方图应该是：即G1期细胞全体都在同一荧光道上63道，G2和M期细胞则位于2*63=126道处，S期细胞位于63—126道之间，由于DNA合成速率不是均一的，因而在这一段范围内不会是均匀分布。第34页，共58页，星期日，2025年，2月5日第35页，共58页，星期日，2025年，2月5日细胞周期和DNA分布直方图

A细胞周期BDNA直方图的理论分布C实际的DNA直方图第36页，共58页，星期日，2025年，2月5日第37页，共58页，星期日，2025年，2月5日

流式细胞仪的技术指标1.荧光分辨率是表明仪器测量所能达到的最大精度，通常用变异系数表示。显然它与被其测定的标准样品有关。2.荧光灵敏度以能检测到最少的FITC分子来表示，即微球上最少标有多少个FITC分子时刚好能被检测到，即定义为荧光灵敏度。第38页，共58页，星期日，2025年，2月5日3．前向角散射光灵敏度以前向角散射光最小能检测到的颗粒直径表示。一般仪器能检测到的最小的直径在0.3um左右。4．前向角散射光分辨率以变异系数表示。一般约在2.0%。第39页，共58页，星期日，2025年，2月5日5．分析/分选速度分析速度可达每秒5000-10000个细胞，分选速度为每秒5000个细胞通过测量区。6.分选纯度分选纯度是个比较复杂的问题，它不但与仪器精度有关，而且与被分选的细胞亚群在整个群体中的相对位置也有关系。如果被分选的亚群在直方图或二维点图上可清晰地分辨出来且与其他亚群无重叠，则分选结果的纯度就高，反之就低。第40页，共58页，星期日，2025年，2月5日7.分选收获率定义为通过测量区应被分选的细胞如果有100个，实际落到指定收集器中的数目为95个，此称为收获率95%。一般应在90%以上。收获率与分选纯度是呈负相关。除以上7个参数外，还有样品浓度，同时可测参数、光源、喷孔尺寸、计算机配置等参数或指标。第41页，共58页，星期日，2025年，2月5日第1页，共58页，星期日，2025年，2月5日概述流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种自动分析细胞的高技术，其原理是悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过测量区，当每一个细胞通过测量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光、光散射，光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速地、大量地测定。第2页，共58页，星期日，2025年，2月5日上述特性可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个细胞群体中分选出来。流式细胞术在当前的细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、遗传学、病理学、临床检验学等各领域有着十分广泛的用途。第3页，共58页，星期日，2025年，2月5日流式细胞术是对悬液中的细胞或细胞器进行快速可达每秒钟数千个乃至上万个细胞。这样，它就可与显微镜相互补充。显微镜术可以研究组织的结构、细胞定位和荧光在细胞中的分布；而多数流式细胞术是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的总核酸，总蛋白等而不能测量细胞中某一特定部位的核酸或蛋白，这是它的不足之处。第4页，共58页，星期日，2025年，2月5日由于现代荧光技术和多参数相关测量技术的发展，流式细