糖代谢与控制 (2).ppt

葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下先生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），并继续由6-磷酸-D-葡萄糖脱氢酶催化转化为6-磷酸-D-葡萄糖酸（6-P-D-Gn）(主要途径）；G也可以在葡萄糖脱氢酶的作用下生成D-葡萄糖酸（Gn），经葡糖酸激酶的催化生成6-P-D-Gn（次要途径）。所生成的6-P-D-Gn在6-磷酸葡糖酸脱氢酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸（D-Rn-5-P）。D-Rn-5-P在5-磷酸核酮糖差相异构酶的作用下生成D-木酮糖-5-磷酸，也可在5-磷酸核糖异构酶的作用下生成D-核酮糖-5-磷酸，后者经酶的作用脱去磷酸便形成目的产物D-核糖。第23页，共70页，星期日，2025年，2月5日三、D-核糖的发酵机制D-核糖发酵是切断HMP途径，使微生物改变酶系，积累阻断反应的前体物，进行代谢控制发酵的典型例子。第24页，共70页，星期日，2025年，2月5日第25页，共70页，星期日，2025年，2月5日由上面的代谢途径可以看出，要使微生物积累D-核糖，必须选育丧失转酮酶活力的突变株，由于缺少转酮酶，所以由转酮酶所催化的反应就会发生阻断，使D-核糖的前体物D-核糖-5-磷酸大量积累，再经酶的作用脱去磷酸便可合成D-核糖。第26页，共70页，星期日，2025年，2月5日四、D-核糖发酵的代谢控制育种1、出发菌株的选择研究发现，芽孢杆菌属（Bacillus）细菌转酮酶缺陷突变株积累核糖具有普遍性。使用不同的亲株，虽然选育出同样的突变型，但产物的种类也会有所差异。如芽孢杆菌属细菌积累戊糖的现象是很普遍的，而大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等细菌的突变株不积累戊糖。因此，多采用芽孢杆菌属细菌作为出发菌株。第27页，共70页，星期日，2025年，2月5日2、转酮酶缺陷突变株的分离分离转酮酶缺陷突变株，可采用以下遗传标记：⑴选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株。D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖必须通过HMP途径进行代谢。若转酮酶发生缺陷，菌体自然也就不能利用D-葡萄糖或L-阿拉伯糖。第28页，共70页，星期日，2025年，2月5日第29页，共70页，星期日，2025年，2月5日⑵选育莽草酸缺陷突变株。莽草酸是由HMP途径中的中间产物——D-赤藓糖-4-磷酸与PEP为前体物而合成的。若转酮酶发生缺陷，则D-赤藓糖-4-磷酸合成受阻，也就不会合成莽草酸。第30页，共70页，星期日，2025年，2月5日第31页，共70页，星期日，2025年，2月5日⑶选育L-Trp缺陷、L-Tyr缺陷、L-Phe缺陷、CoQ缺陷、维生素K缺陷或叶酸缺陷突变株。原理同莽草酸缺陷突变株。第32页，共70页，星期日，2025年，2月5日3、其它标记据报道，在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变，使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力等标记，可使菌体的D-核糖积累量大幅度提高。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属细菌的孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2会发生分子型的变换，结果在菌体对数生长期被诱导，导致D-核糖的大量积累。第33页，共70页，星期日，2025年，2月5日4、利用基因工程技术构建核糖工程菌株岩盾等人将枯草芽孢菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒pUB110中，再将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活。经限制性内切酶酶切后得到线状重组质粒，将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主中，构建出转酮酶失活的D-核糖工程菌株，其D-核糖积累量达52g/L。第34页，共70页，星期日，2025年，2月5日小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到穿梭载体质粒pHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中，构建出D-核糖工程菌株，能积累49g/LD-核糖。第35页，共70页，星期日，2025年，2月5日5、发酵控制D-核糖的发酵培养基的碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉等。有机氮源可以使用干酵母、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆等。为促进生长，尚需添加少量(NH4)2SO4，同时加入适量的CaCO3，以便中和发酵过程中生成的SO42-。由于葡萄糖生成核糖的反应酶系与3个脱氢酶有关，所以，核糖发酵在好气条件下进行。一般要求pH中性，温度37℃左右。第36页，共70页，星期日，2025年，2月5日第37页，共70页，星期日，2025年，2月5日第三节柠檬酸的发酵机制一、概述柠檬酸的应用柠檬酸（Citricacid）又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。第38页，共70页，星期日，2025年，2月5日1)??饮料与