蛋白质组学研究技术进展.ppt

等量不同来源的蛋白样品（一般每个样品100ug）经过还原烷基化、胰酶消化成肽段后，分别用带有不同大小报告基团的iTRAQ试剂进行标记。待标记反应完全之后，将不同报告基团标记的肽段等量混合，利用多维液相色谱对混合肽段进行分离，最终进入质谱进行定性和定量分析。由于标记的肽段的理化性质基本一致，因此不同样品来源的同一肽段将被同时洗脱和离子化。实验流程第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日在进行一级质谱检测时，不同报告基团标记的同一肽段的分子量一致，在谱图中叠加成一个峰，从而便于质谱仪进行母离子选择。在进入二级质谱检测时，母离子碎裂成一系列的碎片离子及报告离子，碎片离子则可以用于肽段的序列鉴定，产生的报告离子则可用于蛋白的定量分析，通过比较不同分子量大小的报告离子质谱峰强度来对不同样品来源的肽段进行定量比较。第32页，共47页，星期日，2025年，2月5日第33页，共47页，星期日，2025年，2月5日关于蛋白质组学研究技术进展第1页，共47页，星期日，2025年，2月5日蛋白质组学背景随着人类基因组计划的完成和对基因组研究的深入，人们认识到单纯依靠基因组信息并不可能完全揭示生命的奥秘。这是因为蛋白质才是生物功能的体现者，所以必需考虑基因编码的蛋白质具有什么功能。第2页，共47页，星期日，2025年，2月5日不仅如此，基因在转录和翻译过程中存在转录和翻译水平的调控,蛋白质往往还要经过剪接、修饰、加工之后，最终才能成为有功能的蛋白质；而且生物体不同组织、不同分化程度和在不同环境下，所表达的蛋白质是不同的，所以单纯从基因组水平上并不能完全揭示生命活动的规律。在这种背景下，蛋白质组学应运而生。1994年，MarcWilkim在Siena双向凝胶电泳(two—dimen．sionalelectrophoresis，2-DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念，并于1995年7月的Electrophoresis(电泳)杂志上发表。第3页，共47页，星期日，2025年，2月5日蛋白质组学是以生物体的全部或部分蛋白为研究对象，研究它们在生命活动过程中的作用、功能。蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确。蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多．对于某一种生物或有机体来说，基因组是唯一的，而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状态而不断变化，因此仅仅从基因的角度来研究是不够的。第4页，共47页，星期日，2025年，2月5日 随着对蛋白质组学的深入理解和具体工作的开展，人们逐渐认识到在短时间内建立蛋白质组学“完整的”数据库和实现网络资源共享是难以实现的，因为条件尚未成熟。于是结构蛋白质组学研究着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，因此，差异蛋白质组学研究技术应运而生。第5页，共47页，星期日，2025年，2月5日1、双向凝胶电泳技术1975年,意大利生化学家O’Farrell（奥法雷尔）发明了双向电泳(two—dimensionalgeleldctropgoresis，2-DE)技术。该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离，即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离．第一向电泳是蛋白质的等电聚焦，根据蛋白质等电点差异进行分离，该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0．01pH单位的蛋白质的分离；第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离，可分离相对分子量在100×103～150×103的蛋白质。第6页，共47页，星期日，2025年，2月5日第7页，共47页，星期日，2025年，2月5日例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。CK-2是对照组，MIR-2是实验组。第8页，共47页，星期日，2025年，2月5日图1用不同裂解液裂解后的CK-2双向电泳图左图裂解液中的去垢剂用的是CHAPS,右图裂解液中的去垢剂是NP-40。第9页，共47页，星期日，2025年，2月5日图2对照样品CK以及和平号搭载样品MIR的双向电泳结果图第10页，共47页，星期日，2025年，2月5日样品MIR-2和对照组CK-2的双向电泳结果进行了IMAGEMASTER软件分析,共找到了42个表达差异2倍以上的蛋白质点,对其中26个差异比较明显的蛋白质点进行了ESIQ-TOFMS/MS质谱分析,共鉴定出10个蛋白质点,鉴定的蛋白质在对照组均表现为上调,在空间站搭载样品中表现为下调。第11页，共47页，星期日，2025年，2月5日