高效菌筛选方法及策略.ppt

五.基因工程技术基因工程是分子水平上在生物体外用人工方法进行ＤＮＡ的重组，以改变生物的性状创造生物的新品种或新物种的一门新学科。对于环境中难以降解的有毒有害化合物，可通过基因工程的方法，设计新的代谢途径，利用相关的基因构建工程菌。这样不仅提高细胞单一酶的浓度增加代谢途径中某一限制酶的表达，还能使代谢途径中所有基因的表达获得同步增加，从而大大提高降解效率，促使有毒化合物分子进一步降解为无害的末端产物。第31页，共78页，星期日，2025年，2月5日五.基因工程主要过程：获得特定的目标基因目标基因片段DNA重组载体DNA进入受体细胞并扩增、表达具目标基因表达功能重组体第32页，共78页，星期日，2025年，2月5日黏性末端黏性末端1、限制性核酸内切酶限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）来源：主要从原核细胞分离作用：作用结果：EcoRI基因工程的“专用工具”平未端及粘性未端第33页，共78页，星期日，2025年，2月5日什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第34页，共78页，星期日，2025年，2月5日要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。第35页，共78页，星期日，2025年，2月5日第36页，共78页，星期日，2025年，2月5日基因的针线：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG同种限制酶切割第37页，共78页，星期日，2025年，2月5日基因的针线——DNA连接酶DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来(形成磷酸二酯键)，这样一个重组的DNA分子就形成了。第38页，共78页，星期日，2025年，2月5日导入过程需要运输工具——运载体。运载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。作用二：利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。第39页，共78页，星期日，2025年，2月5日（一）载体基因克隆载体条件：（1）具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。（2）能携带外源DNA进入受体细胞或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随DNA复制而复制。（3）必须具有遗传标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。第40页，共78页，星期日，2025年，2月5日常用的运载体主要有两类：1）质粒2）噬菌体或某些动植物病毒第41页，共78页，星期日，2025年，2月5日质粒1.质粒的定义：一般来说符合以下3条标准的染色体外的DNA或RNA分子都可以称之为质粒：(1)质粒是染色体外能自主复制的遗传因子；(2)不具备胞外期的感染性；(3)它对宿主来说不是必需的。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型复制的质粒。松弛型质粒在宿主细胞内可含10－200个拷贝，而且不受宿主细胞蛋白质合成的影响，当宿主细胞蛋白质合成停止时，质粒DNA的复制仍可以继续进行，甚至可以将拷贝数增加至数千个。细菌对环境中的特异性限制因子的应答能力一般是由质粒控制的，因此，质粒在为宿主细胞提供遗传多样性及其利