酶组织化学总论.ppt

关于酶组织化学总论第1页，共33页，星期日，2025年，2月5日一.概述酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质高效性103-106倍专一性低反应条件易变性失活降低生化反应的反应活化能第2页，共33页，星期日，2025年，2月5日酶活性的检测方法广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术，都可用来测定酶活性容量法（量气法）比色法与分光光度法荧光法与同位素法离子选择电极法，旋光法分子生物学，免疫化学法等第3页，共33页，星期日，2025年，2月5日酶的组织化学利用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法第4页，共33页，星期日，2025年，2月5日酶组织化学发展历史1868年Klebs组化1939年Takamatsu、Gomori碱性磷酸酶1940-1960年电镜酶组织化学1955年Scheldon酸性磷酸酶免疫酶组织化学1970年Sternberger酶标抗体法目前，用酶组织化学方法能显示的酶已达100余种第5页，共33页，星期日，2025年，2月5日酶的种类1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂解酶5.异构酶6.合成酶第6页，共33页，星期日，2025年，2月5日二.酶组织化学反应的基本知识酶的特性酶的定位酶组织化学的基本原理第7页，共33页，星期日，2025年，2月5日（一）酶的特性水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂有机溶剂不同程度降低酶的活性易受温度影响，对热耐受性弱对干燥耐受性强第8页，共33页，星期日，2025年，2月5日（二）酶的定位酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位5‘-核苷酸酶——浆膜ATPase——肌球蛋白细胞膜线粒体第9页，共33页，星期日，2025年，2月5日(三）酶组化的基本条件同时保存结构和酶的活性保存酶的定位，防止酶的扩散或移位保证反应产物的特异性*影响酶活性的因素：温度PH值抑制剂激活剂第10页，共33页，星期日，2025年，2月5日（四）原理及一般原则第11页，共33页，星期日，2025年，2月5日1.基本原理细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物）然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在第12页，共33页，星期日，2025年，2月5日第一反应：酶促反应底物初级反应产物（PRP）第二反应：捕捉反应PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）酶第13页，共33页，星期日，2025年，2月5日*PRP弥散：1.底物在酶催化下水解的速度2.PRP在缓冲液中的弥散系数3.PRP与辅助物反应的速度应选择合适的底物和辅助物,减少弥散捕捉剂的浓度（1mg/ml）第14页，共33页，星期日，2025年，2月5日2.一般原则对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细胞中所选底物最好只能被一种酶催化分解所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合第15页，共33页，星期日，2025年，2月5日(五)酶组织化学的主要步骤1.酶的固定（fixation）2.酶的特异性反应（specificreaction）3.在最适条件下,酶反应产物的沉着（precipitation）4.使沉着物具有可见性（visualization）组织/细胞制作切片酶反应（孵育）显色封片镜检第16页，共33页，星期日，2025年，2月5日（六）各步骤注意问题检测方法的选择酶的保存与固定一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片-70℃长期保存固定剂1-4%多聚甲醛,福尔马林,戊二醛固定时间固定