常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

第三节基因文库GeneLibrary基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有?噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。010302基因组文库和cDNA文库的构建和筛选基因组文库筛选结果举例第三轮筛选03第二轮筛选02第一轮筛选01二、cDNA文库cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。第四节01生物芯片技术BiologicalChipTechnique02生物化学与分子生物学常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。复性RNADNA印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。0102用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针技术12DNA印迹(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。01RNA印迹(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。02蛋白质的印迹(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。03二、印迹技术的类别及应用斑点印迹(dotblotting)1原位杂交(insituhybridization)2DNA点阵(DNAarray)3DNA芯片技术(DNAchip)4其他：三种印迹技术的比较分子杂交实验放射自显影照片DNA芯片技术第二节PCR技术的原理与应用ThePrincipleandApplicationofPCRTechnology一、PCR技术的工作原理5?Primer15?Primer2Cycle2Cycle15?5?5?5?5?5?TemplateDNA5?5?5?5?5?5?5?5?Cycle35?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PCR技术原理示意图PCR的基本反应步骤01变性0295?C03延伸0472?C05退火06Tm-5?C07模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶Mg2+dNTPsPCR体系基本组成成分利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。（一）目的基因的克隆二、PCR技术的主要用途利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。01PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。02DNA和RNA的微量分析03基因突变0401将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。（四）DNA序列测定02PCR与其他技术的结合可以大大