高级实验技术实时荧光定量PCR.ppt

**不同读板温度对实验结果的影响：86℃第63页，共116页，星期日，2025年，2月5日**?SYBRGreenI的特点和不足不涉及特异的探针，方法设计简单，特异性差；荧光强度依赖于体系中所有的dsDNA分子，不能区分引物二聚体、非特异性扩增片断等；通过绘制溶解曲线可较好地保证特异性。第64页，共116页，星期日，2025年，2月5日**优化的读板温度-高于非特异产物的Tm值-低于目标产物的Tm值AmpliconNon-specificproducts熔解曲线分析的应用第65页，共116页，星期日，2025年，2月5日**TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针第66页，共116页，星期日，2025年，2月5日**TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补第67页，共116页，星期日，2025年，2月5日**RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第68页，共116页，星期日，2025年，2月5日**Taqman探针反应体系的设计引物、探针设计原则：优先选择探针的序列；Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；长度不应超过30碱基，18-30bp,optimal20；5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。第69页，共116页，星期日，2025年，2月5日**Taqman探针反应体系的设计选择合适的模板链，使探针的CsGs；扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现；引物应尽量靠近探针；引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基；避免引物、探针之间的二级结构。第70页，共116页，星期日，2025年，2月5日**引物、探针浓度的优化目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值引物浓度：50nM－900nM探针浓度：50nM－250nM通过多次实验确定各自的浓度和比例Taqman探针反应体系的设计第71页，共116页，星期日，2025年，2月5日**Taqman探针的不足采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高；采用酶外切活性，受酶性能影响；探针标记成本较高。改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA第72页，共116页，星期日，2025年，2月5日**Molecular

BeaconsMolecularBeacons发夹型杂交探针第73页，共116页，星期日，2025年，2月5日**MolecularBeacons茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎荧光素淬灭剂环第74页，共116页，星期日，2025年，2月5日**Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons第75页，共116页，星期日，2025年，2月5日**MolecularBeacons特点和不足对目标序列有很高的特异性；是用于SNP检测的最灵敏的试剂之一；采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低；不能完全与模板结合，稳定性差；探针合成标记较复杂。第76页，共116页，星期日，2025年，2月5日**引物/探针设计和评估相关的免费网站?1．引物/探针的