实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.pptVIP

L/O/G/O大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤注意事项思考题内容一：大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的掌握感受态细胞的概念及其意义。掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。02制备感受态的细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因为操作简便且符合大多数的分子克隆要求，因而被广泛采用。01感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。实验原理实验原理CaCl2法的基本原理：细菌处于低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃进行短时间的热激处理，促进DNA的吸收。CaCl2法简便易行，用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5?106-2?107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。制备出的感受态细胞暂时不用时，加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃，可以保存半年。实验原理提高转化效率要考虑几个重要因素：细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。实验原理021ng的超螺旋态DNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。01质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。实验原理实验原理试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分装保存于干燥的冷暗处。实验原理防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式离心机、无菌操作台、微量移液器、恒温摇床；01材料：菌种E.coliDH5α；02试剂：LB液体培养基、0.1MCaCl2。03实验仪器、材料、试剂将E.coliDH5α单菌落接种于3mlLB培养液中，37℃震荡培养过夜。取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养基中，37℃下震荡培养，至光密度值OD600在0.5~0.6之间（5×107个/ml）。取1mlE.coli液体培养液于1.5ml的离心管中，4000rpm，4℃离心3min。实验步骤快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动作要轻柔，置于冰上30min，4000rpm，4℃离心3min。弃上清，加入lml冻存液（含15%甘油的0.1MCaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮，以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80℃，可保存4~6个月。实验步骤菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用经过多次转接或储存与4℃的培养01宜，可以通过监测培养液的OD600控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为02注意事项进行热激制备感受态细胞时要控制好时间。悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。注意事项影响感受态细胞转化效率的因素有哪01.些？02.思考题实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤注意事项思考题010203040506内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选了解转化的概念及其在分子生物学研究中01选重组子的方法。03的意义。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛02实验目的实验原理转化：