生物技术常用技术技术及应用.ppt

④荧光探针杂交法

目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。（定量PCR详述）。第63页，共108页，星期日，2025年，2月5日

⑤Southern印迹杂交(Southernblot)

第64页，共108页，星期日，2025年，2月5日

6.PCR-ELISA引物双标记：生物素/地高辛、荧光素引物5’端标记生物素+RNA探针标记地高辛将一寡核酸探针固定于微孔板作为捕获探针，变性的PCR产物单链的某一区域与之杂交后，此单链间接地固定于微孔板上。再用一非放射性标记物标记（如生物素）的检测探针与固定于微孔板的PCR产物单链的另一区域杂交。第65页，共108页，星期日，2025年，2月5日7.PCR产物测序方法：双脱氧核苷酸链末端终止法化学裂解法用途：目前一般多用于科研第66页，共108页，星期日，2025年，2月5日五、PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性第67页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照(marker?)有条带，而样品则无；第68页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之二非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第69页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数非特异性扩增第70页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之三拖尾(与非特异性扩增条带明显不同，非特异性扩增带有明显的条带分隔。)现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12第71页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数拖尾第72页，共108页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。使用带有污染的试剂。公用试剂如液体石蜡等污染。操作时手套引起的交叉污染。加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有PCR产物污染，可用有滤筛的吸头避免此类污染。实验室污染。现象：空白对照出现目的扩增产物第73页，共108页，星期日，2025年，2月5日对策：PCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均高压灭菌。Tip头、Eppendorf管等最好一次性使用。操作人员必须戴手套进行操作。试剂小量分装保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖时液体溅出。第74页，共108页，星期日，2025年，2月5日引物二聚体两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。PCR常见问题之五第75页，共108页，星期日，2025年，2月5日9.7PCR技术的发展巢式PCR（nestedPCR）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）扩增长片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno