DB22T 2010-2014 家畜(猪牛羊)戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法.docxVIP

ICS11.220B41

备案号：41804-2014DB22

吉林省地方标准

DB22/T2010—2014

家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法

DetectionofHepatitisEvirusbyRT-PCRinLivestock（pig/cattle/sheep）

2014-02-28发布2014-04-30实施

吉林省质量技术监督局发布

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DB22/T2010—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东，于丹。

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DB22/T2010—2014

家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法

警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒RT-PCR测定方法。本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

戊型肝炎病毒HepatitisEvirus[HEV]

戊型肝炎病毒科成员。一种单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34nm，无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。病毒基因组长约7.2knt，有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于3′端，为主要的结构基因编码区，可编码核衣壳蛋白。

3.2

聚合酶链反应polymerasechainreaction[PCR]

聚合酶链反应（PCR）技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性→复性→延伸三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。

3.3

反转录reversetranscription[RT]

反转录（RT）是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）的过程。

4试剂与材料

4.1引物

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DB22/T2010—2014

引物序列见表1，引物浓度为25mmol/L。

表1特异性引物序列

引物种类

引物名称

特异性引物的核苷酸序列

扩增片段长度（bp）

外引物

HEV-1

5-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3

524

（第1次PCR引物）

HEV-2

5-TGYTGGTTRTCRTARTCCTG-3

内引物

HEV-3

5-ATWCATGGVTCRCCTGTGAA-3

328

（第2次PCR引物）

HEV-4

5-AAATYAATTCTGTCGGRAGC-3

注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。

4.2试剂

4.2.1RNA提取试剂盒

4.2.2RT-PCR试剂盒

4.2.3DNA分子质量标准（DNAMarker）

DNA分子质量标准可采用100bpDNAladderMaker、DNAMarkerDL2000或其它等效产品。

4.2.4其它试剂

4.2.4.1双蒸水：符合GB/T6682中4.2二级水要求；

4.2.4.20.1%DEPC水：见附录A中A.1；

4.2.4.375%无水乙醇：见附录A中A.2；

4.2.4.410mg/mL溴化乙锭（EB）或其替代品：见附录A中A.3；

4.2.4.5凝胶加样缓冲液：见附录A中A.4；

4.2.4.61倍Tris-硼酸电泳缓冲液：见附录A中A.5；

4.2.4.7灭菌1mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）：见附录A中A.6。

4.3材料

4.3.1一次性无菌手套或乳胶手套；

4.3.21.5mL离心管；

4.3.30.2mLPCR反应管；

4.3.