病毒学病毒的检验.ppt

4、绿色荧光蛋白标记用于检测病毒的转录或翻译过程,在活细胞中可直接观察到，不需要固定细胞,也不需要底物或酶。可将绿色荧光蛋白的基因序列插入病毒基因组,不影响病毒蛋白的功能,用重组病毒感染细胞后,即可产生绿色荧光蛋白。可用于研究病毒的亚细胞定位,分析病毒在活细胞中的吸附、侵入、脱壳、复制、装配和释出过程.第63页，共105页，星期日，2025年，2月5日四、病毒的血清学诊断原理是用已知病毒抗原来检测病人或动物血清中有无相应抗体，故须待病人或动物感染后体内产生抗体时才能检出。另外，在采取临床标本及病人、动物血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清(双份血清)进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。第64页，共105页，星期日，2025年，2月5日血清学技术1、免疫荧光技术2、酶联免疫吸附试验（ELISA）3、免疫沉淀技术4、免疫转印技术5、中和试验6、血凝试验和血凝抑制试验7、补体结合试验第65页，共105页，星期日，2025年，2月5日（一）病毒抗原的直接检出除对细胞培养中的病毒可进行鉴定外,对一些血清型类别不多或在常规细胞培养系统中还不能成功培养的病毒,应用免疫荧光技术或酶联免疫吸附实验直接检测病毒抗原是快速而简单的方法。第66页，共105页，星期日，2025年，2月5日1.免疫荧光法(immunofluorescentassay，IF)根据抗原抗体特异性结合的反应特点,将荧光色素与待检病毒的特异性抗体以化学的方法结合起来。将荧光标记了的抗体在特定的条件下浸染标本,使抗体与标本中的抗原(病毒)发生结合反应,细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体结合,在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光,根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。第67页，共105页，星期日，2025年，2月5日免疫荧光(IF)法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点。此方法主要包括直接免疫荧光法、间接免疫荧光法以及在间接法的基础上发展而成的补体结合法。第68页，共105页，星期日，2025年，2月5日2.酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA)ELISA使用病毒特异性抗体检测标本中的病毒抗原。ELISA法用于鉴定病毒具有简便、快速、特异的优点。第69页，共105页，星期日，2025年，2月5日3.免疫沉淀(immunoprecipitation)基于病毒特异性抗体与感染细胞或组织的可溶性提取物中的病毒蛋白的相互作用。病毒蛋白事先经放射性同位素标记的氨基酸进行代谢标记,将病毒与抗体作用,分离抗体-病毒蛋白复合物,然后将病毒蛋白从复合物中解离,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,最后经放射自显影,可观察到病毒蛋白带条。第70页，共105页，星期日，2025年，2月5日该技术可用于分析病毒蛋白的许多特性,如存在于病毒粒子和感染细胞内的病毒蛋白种类,蛋白的分子质量,蛋白的合成动态,亚细胞定位,病毒蛋白与其他病毒或细胞蛋白的结合情况。第71页，共105页，星期日，2025年，2月5日4.免疫转印(immunoblotting)是基于抗体与固定在滤膜上的病毒蛋白质的相互作用。病毒蛋白经聚丙烯配胺凝胶电泳,然后转印到对蛋白质有很强亲和性的滤膜(如硝酸纤维素滤膜)上，经免疫染色(如免疫酶染色)检测结合在膜上的蛋白质。由于结合到膜上的蛋白质是变性的,因此识别非线性抗原表位的抗体不适合用于检测。该方法可用于病毒蛋白的分析,其主要优点在于不需要进行病毒蛋白的标记,因此适用于组织、器官或培养细胞中病毒蛋白的检测。第72页，共105页，星期日，2025年，2月5日（二）病毒抗体的直接检出应用病毒特异性抗原检测病毒感染患者血清中的抗体也是诊断病毒感染的的重要手段，可有IgG和IgM两种。IgM抗体出现于病毒感染早期,可用于快速诊断病毒感染。第73页，共105页，星期日，2025年，2月5日IgG抗体出现较迟,在血清中存在的时间也较长,因此IgG类抗体用于临床诊断必须具有早期和恢复期双份血清,或有随访的血清,两次标本中抗体的效价需有4倍或以上的升高才有诊断价值。第74页，共105页，星期日，2025年，2月5日ELISA或免疫印迹法可检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体,例如,该法已用于HIV患者抗体的确认实验。其他常用的方法还包括:1.中和试验2.补体结合试验3.血凝抑制试验第75页，共105页，星期日，2025年，2月5日1.中和试验(neutralizingtest,NTtest)是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的