生物化学实验四 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳.pptVIP

思考题：什么叫电泳？用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？实验四血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳实验目的1.掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。

2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。分离蛋白质的方法电泳离子交换层析分离方法分子大小溶解度透析和超滤密度梯度离心凝胶过滤等电点沉淀盐析有机溶剂分级分离对配体的特异生物学亲和力电荷吸附性质吸附层析亲和层析实验原理电泳:带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。电泳原理：在一定pH条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。影响电泳迁移率的因素：外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。（一）电泳技术（一）按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：1．滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维素薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)；2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3．凝胶电泳：如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率高；4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。属于微量电泳。区带电泳的分类（二）按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：1．平板式电泳：支持物水平放置；2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳(三)按pH的连续性不同，区带电泳可分为：1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。2．非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。（二）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120?m，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。蛋白质名称等电点（pI）相对分子质量/Mr清蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.805.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~300000血清中几种主要蛋白组分缓冲液pH=8.6pI＜pH血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带请预测血清蛋白电泳区带图清蛋白α1γα2β实验器材及试剂一、器材：醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪子、加样器（可用盖玻片或X胶片或微量加样器）、直尺、铅笔、玻璃板（8cm×12cm）、烧杯、试管、试管架、吸管、电泳仪、电泳槽。二、试剂1、巴比妥缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸馏水，加热溶解。待冷至室温后，再加蒸馏水至1000毫升。2、氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B?0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混匀，加蒸馏水至100ml。3、漂洗液:甲醇45ml、冰醋酸5ml，混匀后加蒸馏水至100ml。?实验步骤1.?准备将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤纸全部湿润，此即?“滤纸桥”。1：滤纸桥2：电极缓冲液3：醋酸纤维素薄膜将醋酸纤维素薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将无光泽面向上，做好标记，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待充分浸透（约40min）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻轻吸去表面的多余缓冲液。2.点样?