蛋白质表征技术.ppt

6.5变性蛋白质的变性：是指蛋白质在某些理化因素影响下，其特定空间结构破坏而导致理化性质改变和生物学活性丧失的现象。蛋白质变性的物理因素有：高温、高压、超声波、紫外线、X射线等。蛋白质变性的化学因素有：强酸、强碱、浓乙醇、重金属、尿素、去污剂等。蛋白质变性的本质：蛋白质变性只破坏二硫键和次级键，而不涉及肽键的断裂，因此一级结构并未破坏。蛋白质变性后性质的改变：溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。Gly-SDS:还原性-SDS：还原剂为DTT或巯基乙醇，样品需煮沸，高级结构破坏，一级结构未被破坏。非还原性SDS(不含还原剂，但含有SDS)，样品不需煮沸，检测蛋白质是否存在二硫键或多聚体，也可简单判断蛋白质是否复性成功。Native：是在不加入SDS、巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰氨凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性和构像。为什么蛋白质纯度检测用非还原性电泳？第31页，共42页，星期日，2025年，2月5日应用：如在临床上用高温、高压、紫外线、75%酒精消毒就是利用了这些变性因素使细菌、病毒的蛋白质变性，从而失去致病作用。在蛋白质的制备过程中，如果提取的目的蛋白是热稳定的，可利用热变形的方法很方便的除去其它杂蛋白。而对于不利的变性则应该尽量避免。第32页，共42页，星期日，2025年，2月5日关于蛋白质表征技术第1页，共42页，星期日，2025年，2月5日1蛋白质的基本概念蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。第2页，共42页，星期日，2025年，2月5日蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，在元素组成上亦有差别。根据蛋白质的元素分析表明，其元素组成依次为：碳(50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19%）、氢（6-7%）硫（0-4%）。有的还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、钼、碘等元素。一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含氮量比较接近而恒定，一般为15—17％，平均为16％。这是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是各种定氮法测定蛋白质含量的计算基础。即用定氮法测得的含氮量乘以6．25，即可算出样品中蛋白质的含量。但有的蛋白质中氮的含量有一定差别，应根据其氮的真实含量进行计算。2蛋白质的元素组成第3页，共42页，星期日，2025年，2月5日3.1氨基酸的结构自然界的氨基酸超过300种，但是组成人体蛋白质的氨基酸有20种，可以看作是羧酸分子中α-碳原子上的氢原子被氨基取代而成的化合物，均属于α-氨基酸，即其氨基和羧基都连接在α-碳原子上。氨基酸碳链表示：其结构可用下列通式表示：注：R代表不同的侧链基团，R不同代表不同的氨基酸3蛋白质结构的基本单位—氨基酸第4页，共42页，星期日，2025年，2月5日各种氨基酸在结构上有下列共同特点：组成蛋白质的氨基酸皆为α-氨基酸。不同的α-氨基酸，其R侧链不同（氨基酸分类的依据）。它对蛋白质的空间结构和理化性质有重要的影响。除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所连接的四个原子或基团互不相同，该碳原子都是不对称碳原子。20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基，所以它是亚氨基酸。半胱氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在。第5页，共42页，星期日，2025年，2月5日3.2氨基酸的分类根据侧链R基团的结构和性质进行分类：1）酸性氨基酸——谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp其R基团含羧基，在pH7时，羧基可解离而使分子带负电荷。游离或在蛋白质中都带负电荷，以酸根形式存在。在蛋白质中与正电基团形成盐键。2）碱性氨基酸——赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His其R基团含碱性基团，在pH7时，这些基团可质子化而使分子带正电荷。3）非极性疏水性氨基酸其R基团无极性、不解离，且为疏水性的。4）不解离的极性氨基酸（极性非电离氨基酸）——羟基氨基酸+巯基氨基酸+甘氨酸其R基团虽有极性但不能解离。5）蛋白质中少见的氨基酸——无遗传密码，来自翻译后加工修饰。第6页，共42页，星期日，2025年，2月5日3.3氨基酸的理化性质3.3.1两性解离及其等电点氨基酸是两性电解质：氨基酸既含羧基,又含氨基,同时能起酸和碱的作用，是两性电解质，在水溶