DB22T 2984-2019 鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB22

吉林省地方标准DB22/T2984—2019

鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法

DoubleantibodysandwichELISAmethodforthedetectionofdeermucosaldisease

2019-05-27发布2019-06-17实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T2984—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。

本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、付晓霞、王雨千。

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DB22/T2984—2019

鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照GB19489执行。

1范围

本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作步骤和结果判定。

本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

鹿粘膜病mucosaldisease

由病毒性腹泻病毒（mucosaldiseasevirus，MDV）引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现，主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。

4试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1PBS，见表A.1。

4.2包被液，见表A.2。4.3洗涤液，见表A.3。4.4封闭液，见表A.4。

4.5pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表A.5。4.6底物溶液（OPD-H2O2），见表A.6。

4.7终止液，见表A.7。

4.8标准阳性，MDVNADL国际标准株用牛肾继代细胞MDBK株培养增值，经反复冻融后制备。4.9标准阴性，pH7.4PBS。

4.10MDV免疫球蛋白，见附录B。

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4.11MDV酶标抗体，见附录C。

5仪器设备

5.1离心机，最高转速15000r/min。

5.2恒温培养箱，温度均匀度≤±1（37℃时）5.3酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。

5.4紫外分光光度计，200nm～1000nm。

6样品处理

6.1样品采集

选择新鲜鹿粪3g～5g装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有冰块的保温瓶（箱）内。每份样品的包装瓶（袋）上均要贴上标签，写明采集地点，编号，时间等。如暂时不进行检测应－80℃保存。

6.2样品处理

取1g采集到的鹿粪样品加入10mLPBS（5.1）中充分混匀，3000r/min离心（6.1）30min，上清液即为待检样品。

7操作步骤

7.1使用前将所有试剂恢复至室温。

7.2在ELISA反应板中加入用包被液（5.2）稀释至1.0mg/mLMDV免疫球蛋白（5.10）100μL/孔，37℃（6.2）包被4h。

7.3弃去板中溶液，加洗涤液（5.3）300μL/孔，轻微晃动反应板，3min后弃去洗涤液；如此操作3次，最后将ELISA反应板置于吸水纸上轻轻拍干。

7.4然后加封闭液（5.4）100μL/孔，37℃封闭1h。7.5重复7.3的操作。

7.6加入待检样品100μL/孔，并设阳性对照（5.8）2孔，阴性对照（5.9）2孔，空白对照1孔，密封ELISA反应板，37℃孵育2h。

7.7重复7.3的操作。

7.8加入酶标抗体（5.11）100μL/孔，密封ELISA反应板，37℃孵育1h