酶联免疫吸附试验的影响因素.ppt

“边缘效应”的排除1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深;2.有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。第29页，共48页，星期日，2025年，2月5日总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，应尽量采用水浴。温育中让微孔板浮于水面上（浸入1/3），或将浸透水的沙布放入一大饭盒中形成湿盒，然后放于温箱中，这样可使微孔板板孔底部直接与37℃水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应溶液的温度迅速与温室平衡。第30页，共48页，星期日，2025年，2月5日五、洗板血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性。第31页，共48页，星期日，2025年，2月5日第32页，共48页，星期日，2025年，2月5日洗板的注意事项1.要有适当的浸泡时间（30-60秒）。2.洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul。3.洗液应调至适当的注出量，每孔应在350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。第33页，共48页，星期日，2025年，2月5日4.洗板次数应与说明书要求一致，尽量不要私自增加或减少洗板次数。5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH值不宜过酸或过碱，保证配出的洗液pH值为7.4±0.2，水质宜新鲜，长菌或有沉淀不宜使用，且用非金属容器保存。第34页，共48页，星期日，2025年，2月5日关于酶联免疫吸附试验的影响因素第1页，共48页，星期日，2025年，2月5日实验过程中的影响因素终止与读数结果的判读试剂加样温育样本洗板显色第2页，共48页，星期日，2025年，2月5日一、标本排泄物血清唾液尿液、粪便分泌物体液第3页，共48页，星期日，2025年，2月5日血清标本脂血标本溶血标本标本的保存标本的离心采血试管第4页，共48页，星期日，2025年，2月5日采血试管1.使用非抗凝标本（血清）；肝素抗凝血浆会增加OD值;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA检测系统中辣根过氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃试管或真空采血管.第5页，共48页，星期日，2025年，2月5日标本采集后，应先将标本37°放置30-60分钟后采用3000r/min离心15-20分钟，取上清液加样。15min3000r/min标本的离心第6页，共48页，星期日，2025年，2月5日标本的离心强行离心分离血清，会使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成假阳（阴）性结果。第7页，共48页，星期日，2025年，2月5日标本的保存1.一周----2～4℃保存；2.超过一周----建议-20℃保存。3.冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓缩而分布不均，加样前应充分混匀。第8页，共48页，星期日，2025年，2月5日标本的保存4.混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。5.作多次检测，宜少量分装冰存;6.血清标本宜在新鲜时检测尽量避免细菌污染。第9页，共48页，星期日，2025年，2月5日 避免细菌污染A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性的HRP会产生假阳性；B.细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶酶等蛋白水解酶）；C.一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。第10页，共48页，星期日，2025年，2月5日溶血标本1.ELISA以辣根过氧化物酶标记抗原或抗体；2.红细胞破坏后可释放出大量的具有过氧化物酶活性的血红蛋白；3.残留的过氧化物酶催化底物产生非特性显色导致结果假阳性。第11页，共48页，星期日，20