T_ZNZ 267-2024 动物源性产品中牛源性成分检测数字PCR 法.docxVIP

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T/ZNZ

浙江省农产品质量安全学会团体标准

T/ZNZ267—2024

动物源性产品中牛源性成分检测数字PCR法

DetectionofBovineingredientinanimaldrivedproducts--DigitalPCRmethod

2024-06-27发布2024-07-27实施

浙江省农产品质量安全学会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。

本文件起草单位：浙江省农业科学院、迈克生物股份有限公司。

本文件主要起草人：纪艺、陈笑芸、付军、彭城、王晓雪、汪小福、徐俊锋。

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动物源性产品中牛源性成分检测数字PCR法

1范围

本文件描述了使用数字PCR检测方法测定动物源性产品中牛源性（不适用水牛）DNA成分的原理、试剂与材料、主要仪器和设备、操作步骤、结果分析与表述、定量限和检出限。

本文件适用于牛源性产品（不适用水牛）DNA成分的定性和定量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

农业部2406号公告-7-2016转基因动物及其产品成分检测DNA提取和纯化。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

数字PCRDigitalPCR

一种核酸绝对定量的PCR技术。将PCR体系分配成大量微反应体系进行PCR扩增，扩增后对微反应体系进行荧光信号阅读，根据阴性反应确定样品拷贝数，通过泊松分布原理计算获得样品中靶序列拷贝数浓度。

4原理

本文件针对牛种属特异序列选取特异性引物和探针进行数字PCR扩增，根据荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果，依据微反应体系的阴、阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的牛种属特异性基因拷贝数浓度。

5试剂与材料

除非另有说明，所有试验仅使用分析纯及以上试剂和无DNase/RNase的重蒸馏水或符合GB/T6682

二级水以上标准的水。

5.1基因组DNA提取相关试剂或动物成分相关DNA提取试剂盒

按照农业部2406号公告-7-2016中4执行或采用等效的动物成分DNA提取试剂盒。

5.2数字PCR反应试剂盒

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按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒。

5.3牛种属特异性序列引物/探针(β-actin基因）

β-actin-F:5′-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3′β-actin-R:5′-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3′

β-actin-P:5′-AGGTGCACAGTACGTTC-3′注1：预期扩增片段大小为62bp（参见附录A）。

注2：β-actin-P为牛种属特异性序列的TaqMan探针，其5′端标记荧光报告基团（如FAM、HEX等），3′端标记对应的荧光淬灭基团（NFQ-MGB）。

6主要仪器和设备

6.1数字PCR系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、PCR扩增仪（变温速率≤2℃/s，

孔间温度差异1.0℃)和微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能仪器的系统。

6.2生物安全柜或超净工作台。

6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

6.4电子天平。

6.5离心机。

6.6微量移液器。

6.7涡旋震荡仪。

7操作步骤

7.1试样制备

遵照农业部2406号公告-7-2016中6.1规定执行。

7.2DNA模板制备

7.2.1DNA的提取与纯化

遵照农业部2406号公告-7-2016中6.3执行或等效采用DNA提取试剂盒提取DNA。

7.2.2DNA浓度和纯度的测定

遵照农业部2406号公告-7-2016中6.4规定执行。

7.3数字PCR扩增

7.3.1对照

优先选用有证标准样品、有证标准物质或以含有牛源性成分的样品作为阳性对照，以不含有牛源性成