细菌的革兰氏染色观察.pptVIP

菌种：模式种—金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（37℃培养20h）；自选种—从土壤分离的细菌菌落任选一种试剂：革氏染液（结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红）、生理盐水、香柏油、二甲苯等；器材：显微镜、酒精灯、接种环、拭镜纸、载玻片。三、实验材料：单染色：涂片→干燥、固定（通过火焰数次）→染色1-2分钟→水洗脱去多余染液→自然干燥或洗水纸吸干→镜检。01革兰氏染色：涂片→干燥、固定→结晶紫染色2分钟→细水冲洗→碘液媒染1分钟→细水冲洗→95%酒精脱色15秒→水洗→蕃红溶液复染1-2分钟→水洗→干燥→镜检。02四、操作步骤：染色操作步骤—涂片固定滴生理盐水挑取菌苔一环涂片热固定干燥取菌液一环涂片干燥细菌的染色观察微生物(Microorganism)形体微小、结构简单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观察。病毒(包括噬菌体)；细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等；真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多细胞）；单细胞的藻类以及原生动物等。→非细胞型微生物→单细胞原核微生物→真核微生物细菌(bacteria)的细胞形态1、球菌单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。2、杆菌细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯，有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半圆。学习微生物涂片、染色的操作技术，掌握细菌单染色法、革兰氏染色的方法；学习并掌握油镜的原理和使用方法。0102一、实验目的：二、原理：二、原理：（一）油镜：显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示：能辨别两点之间最小距离D=λ/（2NA）式中λ=光波波长NA=物镜的数值孔径物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出。我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm。使用NA为0.65高倍物镜，D=0.55/(2x0.65)=0.42μm使用NA为1.25的油镜，D=0.55/(2×1.25)=0.22μm高放大倍数≠高分辨力：40x高倍镜（NA=0.65）和24x目镜，总放大倍数为960，D=0.42μm；100x的油镜（NA=1.25）和9x目镜，总的放大率为900，D=0.22μm。Olympus油镜刻有黑、白双圈，并标有“Oil”字样。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是一层油质，称为油浸系。这种有常选用香柏油(折射率n=1.25，与玻璃相同)，当光线通过玻片后，可直接通过香柏油进入物镜发生折射；如果玻片与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，光线在空气介质中因散射而减弱，这样就减低了视野的照明度。数值孔径:即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）的一半正弦，和玻片与物镜间介质的折射率的乘积。NA=nsinα式中n=介质折射率、α=最大入射角的半数，即镜口角的一半数光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，а的理论限度为900，如当光线入射角为1200，其半数的正弦为sin600=0.87。以空气为介质时NA=1×0.87=0.87；以水为介质时NA=1.33×0.87=1.15;以香柏油为介质时NA=1.52×0.87=1.32。由于细菌微小，无色透明，未经染色往往不易被识别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。01细菌单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较低（pH2-5），故在近于中性的环境中，细菌多带负电荷，易与碱性染料（带正电）结合而着色，因此细菌染色我们一般都用碱性苯胺染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。02单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。03（二）单染色（三）革兰氏染色革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用至今的经典染色法。