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ICS65.020.20B05
DB22
吉林省地方标准DB22/T2988—2019
白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法
VerificationofgenuinenessforPleurotustuoliensisandPleurotuseryngiistrain—ITS-RFLP
2019-05-27发布2019-06-17实施
吉林省市场监督管理厅发布
I
DB22/T2988—2019
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。
本标准起草单位:吉林省农业科学院。
本标准主要起草人:温嘉伟、杨云贵、张维东、谭笑、黄枭、刘迎春、杨大海、滕星、姚丽影、谢江波。
1
DB22/T2988—2019
白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法
1范围
本标准规定了白灵菇和杏鲍菇菌种真实性鉴定ITS-RFLP法的原理、试验条件、试剂、设备仪器、样品、试验步骤、试验数据处理、试验报告。
本标准适用于白灵菇和杏鲍菇菌种(母种、原种和栽培种)真实性检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8979-2008纯氮、高纯氮和超纯氮
NY/T1730-2009食用菌菌种真实性鉴定ISSR法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
ITS-RFLPinternaltranscribedspacer–restrictionfragmentlengthpolymorphism内转录间隔区-限制性片段长度多态性。
3.2
白灵菇Pleurotuseryngiivar.tuoliensisC.J.Mou
侧耳属,刺芹侧耳变种或亚种,子实体通体白色。(GB/T-12728)3.3
杏鲍菇Pleurotuseryngii
又名刺芹侧耳,菌柄白色,菌盖灰褐色。3.4
PCR扩增polymerasechainreaction聚合酶链式反应。
4原理
利用真菌内转录区域保守的引物ITS1和ITS4,扩增真菌内转录区域,然后对PCR产物进行酶切,根据酶切片段大小对白灵菇和杏鲍菇菌种真实性进行鉴定。
5试验条件
2
DB22/T2988—2019
DNA提取、PCR反应体系配制、PCR扩增、电泳等功能区域应采取分区操作,避免交叉感染。
6试剂与材料
除非另有说明,在分析中仅适用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。6.1超纯水(ddH2O):符合GB/T6682规定的二级水,密封、4℃保存。
6.210mol/L氢氧化钠溶液:在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后,冷却至室温,再加水定容至200mL。
6.3500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0):称取18.6g乙二胺四乙酸二钠,加入70mL水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见6.4)直至EDTA-Na2完全溶解,用氢氧化钠溶液(见6.4)调pH至8.0,加水定容至100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.41mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.51.5mol/L氯化钠(NaCL)溶液:在160mL水中加入17.6g氯化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容至200mL。
6.6三氯甲烷(CHCL3):避光、密封、4℃保存。;6.7异戊醇(C5H12O):避光、密封、4℃保存。
6.8乙醇(C2H6O):密封、室温保存。
6.9dNTPs混合溶液:将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。避光、密封、-20℃保存。
6.10高保真度的Ta
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