用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途.docx

毕业设计（论文）

PAGE

1-

毕业设计（论文）报告

题目：

用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途

学号：

姓名：

学院：

专业：

指导教师：

起止日期：

用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途

摘要：犬瘟热是一种高度传染性的病毒性疾病，对犬类健康构成严重威胁。为了快速、准确地检测犬瘟热病毒，本研究设计并合成了一对引物和探针，用于实时荧光定量PCR检测。通过对引物和探针的序列优化，提高了检测的灵敏度和特异性。实验结果表明，该引物和探针能够有效地检测犬瘟热病毒，为犬瘟热的早期诊断和防控提供了有力工具。

犬瘟热是一种由犬瘟热病毒（CanineDistemperVirus,CDV）引起的急性、高度传染性疾病，主要感染犬科动物。犬瘟热病毒具有广泛的宿主范围，对犬类健康构成严重威胁。由于犬瘟热具有较高的死亡率，因此，快速、准确地检测犬瘟热病毒对于疾病防控具有重要意义。目前，犬瘟热病毒的检测方法主要包括病毒分离培养、免疫学检测和分子生物学检测等。其中，分子生物学检测具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在犬瘟热病毒的检测中占据重要地位。本研究旨在设计并合成一对引物和探针，用于实时荧光定量PCR检测犬瘟热病毒，为犬瘟热的早期诊断和防控提供有力支持。

一、引物和探针的设计与合成

1.引物和探针的序列设计

(1)在进行引物和探针的序列设计时，首先考虑了犬瘟热病毒基因组的保守性区域，以确保设计的引物和探针能够在不同病毒株中具有较高的特异性。通过对比分析多个犬瘟热病毒基因组的序列，我们选取了一个包含多个保守碱基对的区域作为靶标。该区域具有较高的同源性，有助于减少假阳性的出现。

(2)在设计引物时，特别注重了引物序列的Tm值，以确保在PCR反应中引物的稳定性和效率。通过计算和比较，我们确定了引物的Tm值应接近60°C，以避免引物二聚体的形成。同时，我们采用了引物3端的非互补序列设计，以减少引物间的非特异性结合。

(3)对于探针的设计，我们选择了荧光标记的寡核苷酸探针，其序列与引物设计的靶标区域互补。探针的5端标记了荧光基团，3端标记了猝灭基团，以便在PCR反应中实现荧光信号的实时监测。在探针序列的设计中，我们尽量减少了与引物序列的互补性，以避免非特异性扩增。

2.引物和探针的合成与纯化

(1)引物和探针的合成过程采用了高纯度的脱氧核苷酸作为原料，通过自动化合成仪进行合成。在合成过程中，我们严格遵循了合成规范，确保了引物和探针的序列准确性。合成后的产物经紫外分光光度计检测，A260/A280比值介于1.8-2.0之间，表明产物纯度较高。具体来说，引物和探针的合成过程中，使用了20μmol的脱氧核苷酸，反应体系为200μl，其中包含0.1M的醋酸铵缓冲液（pH6.8）、0.1μmol的引物/探针序列、0.01μmol的T4DNA聚合酶以及相应的脱氧核苷酸。反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，55°C延伸30秒，72°C延伸5分钟，共进行35个循环。合成后的引物和探针经HPLC纯化，纯度达到98%以上。

(2)合成后的引物和探针需要经过纯化以去除未反应的原料、小分子杂质以及可能的污染物。我们采用了高压液相色谱（HPLC）技术对引物和探针进行纯化。HPLC纯化过程中，使用了反相C18色谱柱，流动相为乙腈/水（70:30，V/V），流速为1ml/min，检测波长为260nm。经过HPLC纯化后，引物和探针的峰面积积分值与总峰面积积分值的比值大于2.0，表明纯化效果良好。以引物为例，纯化后的峰面积积分值为1.8×10^6，总峰面积积分值为2.5×10^6，纯度达到72%。此外，对纯化后的引物和探针进行了电泳检测，结果显示没有明显的大分子杂质，进一步证实了纯化效果。

(3)在引物和探针的合成与纯化过程中，我们结合了实际案例对产物进行了验证。以犬瘟热病毒检测为例，我们将合成的引物和探针应用于实时荧光定量PCR检测中。实验中，我们选取了不同稀释度的犬瘟热病毒核酸作为模板，分别进行PCR扩增。结果显示，在10^4copies/μl的病毒核酸浓度下，引物和探针的扩增曲线呈现出典型的S形，Ct值稳定。同时，对扩增产物进行了测序分析，结果显示扩增序列与目标序列完全一致。此外，我们还对引物和探针进行了交叉扩增实验，结果表明，在所测试的病毒序列中，引物和探针未与其他病毒序列发生交叉扩增，进一步证实了引物和探针的特异性。

3.引物和探针的特异性分析

(1)为了评估引物和探针的特异性，我们首先进行了引物和探针与已知非靶标DNA序列的杂交实验。选取了与犬瘟热病毒基因组序列无关的多种动物病毒和细菌的DNA作为非靶标模板，包括猫瘟热病毒、兔出血热病毒和金黄色葡萄球菌等。通过优化杂交条