细胞培养基本知识基本技术.pptVIP

研究的条件可以人为控制研究内容方便观察、检测、记录研究的样本均一研究的费用相对于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。优点：细胞培养技术的特点及应用应用病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产……免疫学：杂交瘤-单克隆抗体……遗传学：染色体分析……肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物……分化及发育：刺激使细胞群体发生改变……细胞毒实验：药效测试……临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……二、培养细胞生长的条件营养需要环境要求无毒及无污染1、细胞的营养需求（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子（2）促生长因子等完全培养基的组成：基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升基础培养基的选择参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12等……血清热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清(目前少用）热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。?热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清血清质量好坏是实验成败的关键。01常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。02优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。03pH调整液NaHCO3溶液（碱）常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2mlHEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L01020304抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。最终使用浓度为每毫升100单位。制备1000mlRPMI?1640培养基RPMI?1640?干粉培养基10.4g（1包）

超纯水?400ml

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磁力搅拌至完全溶解?

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加超纯水定容至1000ml

在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20℃保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。消化液分离组织和分散细胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)单独或混合使用胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Han