四膜虫TCD3和TCD4蛋白关键结构域截短蛋白表达纯化及其在体外对相分离的影响.pdf

中文摘要

相分离的发生是将细胞内一些组分通过形成液滴的形式包裹起来，形成无膜细

胞器，从而导致与其它细胞成分分离开的一种现象，通常被称为液-液相分离（Liquid-

liquidphaseseparation，LLPS）。LLPS也可以进一步转变为液-固相分离（Liquid-solid

phaseseparation，LSPS）。LLPS形成的无膜细胞器参与了多种重要的生命活动过程，

从细胞信号传导到RNA代谢、应激适应以及转录等。相分离发生异常将导致癌症和

神经退行性疾病等与衰老相关的许多疾病。虽然越来越多的研究显示，相分离在生物

发育和疾病发生过程中发挥重要作用，但是对其介导的分子机制仍不清楚。

Chromodomain蛋白是一类与染色质结构形成、稳定性维持、染色质重塑和基因

表达调控密切相关的超家族蛋白质。在果蝇、小鼠、人等的Chromodomain蛋白家族

的蛋白可以通过LLPS调控异染色质的形成。嗜热四膜虫TCD3和TCD4是两个HP1

类似蛋白，之前的研究显示，过表达TCD3和TCD4可以定位到无膜细胞器conjusome

结构上，并且体外表达纯化的TCD3可以发生LLPS，TCD4可以发生LSPS。本课题

通过基因重组、体外蛋白表达纯化和相分离发生检测等技术，对TCD3和TCD4的

内源表达定位进行观察，并对体外截短TCD3、TCD4关键结构域的相分离发生模式

进行分析。主要获得以下结果：

1、内源表达的TCD3-inEGFP和TCD4-inEGFP动态定位在无膜细胞器

conjusome和细胞核上为了解TCD3和TCD4蛋白是否在四膜虫体内有相分离发生

现象，构建重组质粒pNeo4-inEGFP-TCD3和pNeo4-inEGFP-TCD4并获得TCD3-

inEGFP和TCD4-inEGFP不同配对型突变细胞株。荧光定位观察显示，TCD3-

inEGFP动态定位到有性生殖时期的胞质内和conjusome结构及新发育的大核上。与

四膜虫中参与新大核发育基因组重排的标志性蛋白PDD1共定位结果显示，TCD3-

inEGFP与PDD1蛋白部分共定位在conjusome和新大核上。TCD4-inEGFP则动态

定位到胞质内和conjusome、新大核及亲本大核上。其与TCD3-inEGFP在定位出现

时间和定位模式上不完全相同。荧光漂白恢复（Fluorescencerecoveryafter

photobleaching，FRAP）实验表明，TCD3-inEGFP和TCD4-inEGFP在conjusome和

新大核中都具有一定的流动性。

2、TCD3和TCD4蛋白都通过疏水和静电相互作用共同驱动LLPS的形成构

I

建获得p6His-SUMO-mEGFP、p6His-SUMO-mEGFP-TCD3和p6His-SUMO-mEGFP-

TCD4重组质粒，并将它们在大肠杆菌中表达。经表达条件和纯化条件优化，获得电

泳纯蛋白。以6His-SUMO-mEGFP蛋白为对照，在蛋白的终浓度为1mg/mL时，4%

的PEG终浓度条件下，6His-SUMO-mEGFP不会发生相分离，6His-SUMO-mEGFP-

TCD3和6His-SUMO-mEGFP-TCD4都可以发生LLPS。在添加终浓度为10%的1,6-

己二醇（1,6-Hexanediol，1,6-HD）后，液滴被打散。表明6His-SUMO-mEGFP-TCD3

和6His-SUMO-mEGFP-TCD4的相分离发生都可以通过疏水作用被驱动；用不同浓

度NaCl进行相分离情况检测时发现，随着NaCl浓度的增加，6His-SUMO-mEGFP-

TCD3和6His-SUMO-mEGFP-TCD4形成的液滴都被打散成越来越小的液滴，说明

6His-SUMO-mEGFP-TCD3和6His-SUMO-mEGFP-TCD4的相分离还受到静电相互

作用的驱动。

3、TCD3的结构域LCD和CD对相分离形成模式起相反作用对TCD3蛋白的

结构域预测，显示其包含两个Chromodomain结构域（CD1、CD2）和两个低复杂度

区（LCD1和LCD2）。分别构建TCD3截短