T_SDVMA 004-2024 鉴别羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的双重荧光定量PCR 方法.docxVIP

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团体标准T/SDVMA004-2024

鉴别羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的双重荧光定量PCR方法

AdualfluorescentquantitativePCRmethodfordistinguishingovinepoxvirusfromorfvirus

2024-12-12发布2024-12-12实施

山东省兽医协会发布

T/SDVMA004—2024

Ⅰ

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的

规则起草。

本文件由山东省兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、西南大学、滨州市疾病预防控制中心、深圳市康百得生物科技有限公司、山东绿都生物科技有限公司、聊城职业技术学院。

本文件主要起草人：王金良、叶超、张丽芳、王海丽、孟卫芹、魏凤、邓凤林、徐倩倩、姚春阳、莫玲、徐晴晴、吕素芳、郭广君、唐娜、郭时金、陈金龙、胡绍良。

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鉴别羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的双重荧光定量PCR方法

1范围

本文件规定了羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒荧光定量PCR方法样品采集、保存与运输，以及鉴别检测要求。

本文件适用于羊痘病毒与羊传染性脓疱病毒的鉴别检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂或材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯。

4.1水，GB/T6682，一级。

4.2磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取Na2HPO4?12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

4.3引物：引物名称和序列见附录A。

4.4商品化病毒核酸提取试剂盒。

4.5商品化荧光定量PCR反应试剂。

4.6羊痘病毒阳性对照：含有扩增羊痘病毒目的基因序列的质粒DNA。

4.7羊传染性脓疱病毒阳性对照：含有扩增羊传染性脓疱病毒目的基因序列的质粒DNA。

4.8阴性对照：灭菌水。

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5仪器设备

5.1电子天平：精度0.01g。

5.2荧光定量PCR检测仪。

5.3高速冷冻离心机：可控温至4℃,转速≥12000r/min。

5.4高压蒸汽灭菌器。

5.5二级生物安全柜。

5.6超低温冰箱：可控温至-70℃以下。

6样品采集、保存与运输

6.1采样注意事项：采样过程中应按照NY/T541规定执行，采样及样品处理过程中做好个人防护，样品间不得交叉污染。

6.2组织样品采集：发病活体羊的皮肤丘疹、鼻唇部脓疱或硬痂、口腔拭子或病死剖检羊的肺、淋巴结等组织5g～10g，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号标记，置于样品冷藏箱送至实验室。

6.3保存：采集样品在2℃~8℃条件下保存，时间应不超过24h；若需要长期保存，应放置-70℃冰箱。

6.4运输：采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在2℃~8℃条件下24h内运送到实验室。做好生物安全标识。

7试验步骤

7.1样品处理

7.1.1组织样品：样品加入5倍体积灭菌水，充分研磨，4℃、10000r/min离心5min，取上清液转入离心管中编号备用。

7.1.2细胞培养物：1mL细胞培养物置于离心管内，反复冻融3次，4℃、10000r/min离心10min，取上清液转入离心管中编号备用。

7.1.3疫苗样品：加入2mL的PBS，溶解，混匀，4℃、10000r/min离心10min，取上清液转入离心管中编号备用。

7.2核酸提取

按照GB19489规定执行，采用商品化试剂盒提取病毒核酸。

7.3荧光定量PCR检测