酶联免疫吸附试验 (2).ppt

比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。酶标比色仪检测酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。第30页，共41页，星期日，2025年，2月5日结果判断定性测定对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示定量测定在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标准曲线得到样品中待测抗原的量。第31页，共41页，星期日，2025年，2月5日关于酶联免疫吸附试验(2)第1页，共41页，星期日，2025年，2月5日实验目的要求掌握ELISA的基本原理掌握ELISA双抗体夹心法检测HBsAg的原理、操作方法及结果判断熟悉表面抗原检测的临床意义第2页，共41页，星期日，2025年，2月5日（一）ELISA的原理ELISA的基本原理三种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）②酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）③酶作用的底物第3页，共41页，星期日，2025年，2月5日在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。第4页，共41页，星期日，2025年，2月5日加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

第5页，共41页，星期日，2025年，2月5日（二）方法类型及反应原理双抗体夹心法间接法竞争法捕获法第6页，共41页，星期日，2025年，2月5日1双抗体夹心法——是检测抗原最常用的方法第7页，共41页，星期日，2025年，2月5日第8页，共41页，星期日，2025年，2月5日操作步骤1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。第9页，共41页，星期日，2025年，2月5日应用此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

第10页，共41页，星期日，2025年，2月5日2间接法——是检测抗体常用的方法第11页，共41页，星期日，2025年，2月5日第12页，共41页，星期日，2025年，2月5日基本步骤1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色。第13页，共41页，星期日，2025年，2月5日应用检测Ab的最常用的方法只要更换不同的固相Ag，可以用一种酶标二抗检测各种与Ag相应的Ab。第14页，共41页，星期日，2025年，2月5日3竞争法第15页，共41页，星期日，2025年，2月5日其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。方法相同第16页，共41页，星期日，2025年，2月5日ELISA的基本步骤包被—洗涤—封闭—洗涤—加样—加酶结合物—加底物、显色剂—终止液—酶标仪检测第17页，共41页，星期日，2025年，2月5日包被将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板