DB32T 1769-2011 马链球菌兽疫亚种的检测PCR 方法　.docxVIP

ICS65.020.30

B41

备案号：

DB32

江苏省地方标准DB32/T1769—2011

马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法MethodofPCRfordetectingStreptococcuszooepidemicus

2011-05-06发布2011-07-06实施

江苏省质量技术监督局发布

I

DB32/T1769—2011

前言

为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。

本标准由江苏省农业科学院提出。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、李成仁、李彬、王小敏。

1

DB32/T1769—2011

马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法

1范围

本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。

本标准适用于马链球菌兽疫亚种的PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3原理

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。本标准根据GenBank上公布的马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。

4仪器设备和主要试剂

4.1仪器设备

4.1.1高速离心机

4.1.2水浴锅

4.1.3PCR仪

4.1.4核酸电泳仪

4.1.5凝胶成像系统4.2主要试剂

除另有规定，所用试剂均为分析纯。4.2.1生理盐水

4.2.2蛋白酶K

4.2.3Taq酶

4.2.4dNTP

4.2.5琼脂糖，电泳级

5引物

2

DB32/T1769—2011上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′；下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。

6方法步骤

试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。6.1样品处理

6.1.1病料样品处理

采用差速离心法：取约5g病料，剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r/min离心2min，去除大组织块，取上清液，后10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。

6.1.2可疑培养物样品处理

取可疑培养物1mL10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以200μL灭菌水重悬，备用。阴性对照：液体培养基。

阳性对照：马链球菌兽疫亚种液体培养物。

阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2DNA提取

取ddH2O溶解的样品，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min离心5min，上清作为模板。

6.3PCR扩增

6.3.1反应条件

按25μL体系进行，10×buffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.5μL，dNTP（2.5mM）1.0μL，上游引物（50pmol/μL）0.5μL，下游引物（50pmol/μL）0.5μL，模板DNA3.0μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，灭菌水15.5μL。按如下条件进行PCR反应。95℃5min，然后进入循环94℃1min，60.2℃1min，72℃1min，35个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。

6.3.2电泳

将PCR反应产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为12