DB32T 1775-2011 I型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR 方法　.docxVIP

ICS65.020.30

B41

备案号：

DB32

江苏省地方标准DB32/T1775—2011

I型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingDuckVirusHepatitisI

2011-05-06发布2011-07-06实施

江苏省质量技术监督局发布

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DB32/T1775—2011

前言

为规范I型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术，提高鸭肝炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编写》编制。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由江苏省农业科学院提出。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。

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DB32/T1775—2011

I型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法

1范围

本标准规范了I型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。

本标准适用于检测鸭肝脏和病毒尿囊液中I型鸭肝炎病毒核酸。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样

3方法原理

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术却以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了DHVIVP1基因的保守，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性试验等，对DHVI的鉴定具有很高的准确性。

4仪器设备和主要试剂

4.1仪器设备：PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统

4.2主要试剂：TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。

5引物

上游引物：5′-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3′；下游引物：5′-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3′。

6样品采集

按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸭，无菌采集肝脏组织。

7方法步骤

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DB32/T1775—2011

试验用水：按照GB-T6682-2008三级水标准7.1样品处理

取病料0.5g～1g置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨，将研磨好的组织，用生理盐水1︰5稀释，以4℃12000r/min离心10min，取上清200μL备用。

阴性对照：没有发病的正常鸭肝脏

阳性对照：用中和试验检测DHV阳性肝脏样品（见附录A）7.2DHVRNA的提取

取已处理的待检样品，以DHV阳性病毒为阳性对照，以正常肝脏作为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol600μL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200μL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000r/min，离心15min，取上层水相750μL，加入500μL异丙醇，混匀，﹣20℃放置15min，4℃12000r/min,离心15min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000r/min离心5min，去上清，室温干燥RNA样品沉淀20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解。

7.3RT-PCR

反转录反应：5×AMVBuffer4μL、10mmol/LdNTPs2μL、下游引物1μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板10μL，AMV反转录酶0.5μL，H2O（DEPC处理）2μL，总体积为20μL，瞬间离心混匀，65℃