DB32T 1730-2011 养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法　.docxVIP

ICS65.150

B50

备案号：

DB32

江苏省地方标准DB32/T1730—2011

养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法Fluorescencemicroscopycountingmethodwasusedtomeasurethecount

ofaquaculturewaterbacteria

2011-04-15发布2011-06-15实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T1730—2011

前言

本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。本标准的附录A为资料性附录。

本标准由江苏省海洋与渔业局提出。

本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所。本标准主要起草人：杨鸢劼、陈大鹏。

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DB32/T1730—2011

养殖水体细菌总数测定--荧光显微计数法

1范围

本标准规定了荧光显微计数法测定养殖水体细菌总数的试剂、仪器设备、操作步骤、计数方法和计算。

本标准适用于养殖水体细菌总数的测定，也适用于环境水域。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T4789.28食品卫生微生物学检验、染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T18088出入境动物检疫采样

3原理

细菌组织细胞经阳离子荧光探针--吖啶橙（AcridineOrange，AO）荧光色素染色后，以嵌入或静电吸引与蛋白DNA/RNA相结合。在生物荧光显微镜高压汞灯发射光谱激发光下（200~600nm），活菌细胞和受损细胞（死细胞）分别产生黄绿色到绿色荧光和橙色到红色荧光。镜检计数待检样品中活菌细胞和死菌细胞数，同时也可以计数总菌数。

4试剂

所用试剂除特别说明外，药品均为分析纯(AR)。无菌水均为经0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子

水，符合Ⅰ级水的规格。4.1甲醛溶液(40%)

4.2萘啶酮酸溶液（0.002%）

萘啶酮酸（C12H12N2O3）0.002g

无菌水100mL

待萘啶酮酸充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.3酵母膏溶液（0.025%）

酵母膏（生化试剂）0.025g

无菌水100mL

将酵母膏在无菌水中加热，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.4氢氧化钠溶液（4%）

氢氧化钠（NaOH）无菌水

4g

100mL

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DB32/T1730—2011

4.5磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05）

磷酸二氢钾（KH2PO4·2H2O）34g

无菌水500mL

待磷酸二氢钾充分溶解后，用NaOH溶液调整pH7.2±0.05，4℃保存。4.6吖啶橙染色溶液（0.1%）

吖啶橙（C17H19N3·HCl·0.5ZnCll2）10mg

磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05）100mL

将吖啶橙和磷酸盐缓冲液混合，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌棕色试剂瓶，室温保存，有效期6个月。操作时需戴手套。

4.7苏丹黑B溶液

苏丹黑B（C29H24N6）无水乙醇（C2H6O）无菌水

100mg

75mL

75mL

将苏丹黑B在乙醇中充分溶解后，再与无菌水混合，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置棕色试剂瓶暗处保存，有效期6个月。

4.80.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)

碳酸氢钠（NaHCO3）3.7g

碳酸钠（Na2CO3）0.6g

无菌水600mL

将碳酸氢钠和碳酸钠在无菌水中充分溶解后置试剂瓶，密封保存。4.9缓冲甘油封片剂

碳酸盐缓冲液(pH9.0-9.5)10mL

无荧光甘油（C3H8O3）90mL

按比例将碳酸盐缓冲液和无荧光甘油在搅拌器上充分混匀后4℃保存，待气泡排除后方可使用。

4.10无荧光显微镜物镜镜油TypeFF（Nd=1.516）

5仪器及设