T_SDVMA 003-2024 鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的双重PCR 方法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准T/SDVMA003-2024

鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的双重PCR方法

AdualPCRmethodfordistinguishingPasteurellamultocidafromMannheimiahaemolytica

2024-12-12发布2024-12-12实施

山东省兽医协会发布

T/SDVMA003—2024

Ⅰ

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的

规则起草。

本文件由山东省兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、滨州市疾病预防控制中心、阳信县畜牧兽医管理服务中心、滨州市检验检测中心、山东绿都生物科技有限公司、深圳市康百得生物科技有限公司。

本文件主要起草人：王金良、张丽芳、丁卫平、徐晴晴、王凯、徐倩倩、邓凤林、莫玲、孟卫芹、姚春阳、郭广君、唐娜、郭时金、陈金龙、胡绍良。

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鉴别多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的多重PCR方法

1范围

本文件规定了多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌PCR鉴别检测方法。本文件适用于多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌的鉴别检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T563禽霍乱（禽巴氏杆菌病）诊断技术

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂或材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯。

4.1水，GB/T6682，一级。

4.2磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取Na2HPO4?12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

4.3引物：引物名称和序列见附录A。

4.4商品化的PCR反应试剂。

4.5商品化的凝胶电泳试剂。

4.6阳性对照：分别含有多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌扩增目的基因的阳性质粒。

4.7阴性对照：灭菌水。

5仪器设备

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5.1PCR扩增仪。

5.2高速冷冻离心机：可控温至4℃,转速≥12000r/min。

5.3高压蒸汽灭菌器。

5.4二级生物安全柜。

6试验步骤

6.1样品处理

对分离鉴定和纯化培养的细菌液体培养样品，直接保存于1.5mL无菌离心管中，密封，编号，保存，送检。

6.2核酸提取

取1mL菌液加入1.5mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清，加入100μL无菌水中，混匀，沸水浴10min，冰浴5min，12000r/min离心1min，上清液作为基因扩增的模板。

6.3PCR检测

6.3.1反应体系的配制：反应体系的配制按照附录B表B.1。

6.3.2加样：在各设定的PCR管中分别加入阳性对照、阴性对照和提取的试样溶液2μL，盖紧管盖，混匀，瞬时离心。

6.3.3反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸6min，结束反应。

7结果判定

7.1试验成立条件

当阳性对照扩增出约460bp、206bp的片段，阴性对照未扩增出片段时，试验成立，见附录C图C.1。

7.2阳性结果判定

被检样品扩增出约460bp的片段，则判定被检测样品中含有多杀性巴氏杆菌核酸；被检样品扩增出约206bp的片段，则判定被检测样品中含有溶血性曼氏杆菌核酸；被检样品扩增出约460bp和206bp的片段，则判定被检测样品中含有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌的核酸。

7.3阴性结果判定

被检样品未扩增出约460bp的片段，则判定被检测样品中不含有多杀性巴氏杆菌核酸；被检样品未扩增出约206bp的片段，则判定被检测