细胞融合及其应用.pptVIP

1、什么是单克隆抗体？回顾抗体基础知识抗体的化学本质是什么？抗体由何种细胞产生？用传统的方法如何获得抗体？思考？（三）单克隆抗体技术能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B细胞）。抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。BA抗体的传统生产方法抗原反复注射动物血清中分离抗体如何解决这个问题呢？所有抗体混合人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，而每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。单克隆抗体：单个B细胞克隆产生的化学性质单一、特异性强的抗体。12提示1：B细胞可以进行无限增殖吗？提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞动物细胞培养技术设计方案：动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体，又能大量增殖的细胞1975年科学家米尔斯坦和柯勒的实验BB、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一选）选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能存活获得产生相应抗体的B细胞（二选）：选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞√体外培养小鼠腹腔内培养2、制备单克隆抗体流程动物免疫与免疫脾细胞制备骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选特异性杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞克隆化培养和冻存McAB的大量制备单克隆抗体的鉴定制备单克隆抗体的基本技术文献解读仙台病毒：亦称HVJ（HemagglutinatingvirusofJap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。１９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。生物法—病毒法疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒12345病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一个单价血细胞凝集素；刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面。仙台病毒紫外线丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）程序：紫外线将病毒灭活，稀释到一定浓度，加入到细胞悬液中，离心，诱导细胞融合。优点：融合效率高，适合于各种动物细胞；仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。缺点:仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易失活，容易对细胞产生干扰；3.影响融合的因素1植物细胞融合：植物原生质体融合无种属特异性，融合效率只与外界条件有关。PEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融合；PEG的规格和纯度，分子量多为4000－6000。电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2×104－8×104电融合时，加入少量CaCl2,可维持电导率，保护细胞；交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。添加促融合剂，可提高融合率。亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容易；表面光滑的不易融合；细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴细胞或血球细胞不易融合。融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，37度、振荡。需氧量大，缺氧常不融合。需要Ca2+，最适浓度为0.1mol/L。最适pH值为7.4－7.8。3.2动物细胞融合体细胞杂种的遗传特性细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。0102四、杂种细胞的筛选和鉴定基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。I、植物细胞筛选方式两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成