苯硫脲尝味的群体遗传学调查.pptVIP

苯硫脲尝味的群体遗传学调查1.实验目的测定人群中PTC尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。了解酶切扩增多态序列（cleavedamplifiedpolymorphicsequence，CAPS）（又称为PCR-RFLP）技术的原理，学会用CAPS技术检测单核苷酸多态性（SNPs）。在分子水平上测定PTC尝味的基因型。计算群体中PTC尝味的基因频率，判断群体是否达到Hardy-weiberg平衡。2.实验原理晶物也尝不出苦味）的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物（图2.1），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000~1/50,000PTC浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者,只能尝出PTC浓度大于1/24,000溶液的味道（甚至对PTC的结图2.1苯硫脲结构图PTC尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7号染色体上（7q35-7q36）的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1／750,000~1／6,000,000的PTC溶液的苦味，杂合子(Tt)只能尝出1／480,000～l／380,000的PTC溶液的苦味。因此可以利用对PTC的尝味能力测定家族中的基因传递和人群中的基因频率。2.2人类苯硫脲尝味的基因人类的PTC尝味基因Homosapienstastereceptor,type2,member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38或T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)：一处是145位，味盲者为G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处在886位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味者为G886（编码缬氨酸val）。因此味盲者PTC多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262和ile262，被称为AVI等位基因，而尝味者的三处是pro49、ala262和val262，被称为PAV等位基因（图2.2，2.3）味盲者的PTC编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1的识别位点（识别序列5’-GC↓NGC-3’），如果是尝味者，则其第785位SNP恰好形成了一个额外的Fnu4H1识别位点（GCTGC）。因此可以利用这个SNP造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含785位SNP位点的PTC基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。实验技术路线4.实验步骤4.1讲解实验目的、实验原理、实验技术路线；实验方法及注意事项；主要仪器设备使用方法、注意事项；（提前一周讲解，给学生准备时间）（1）讲解实验目的、实验原理、实验技术路线。（2）讲解口腔上皮细胞总DNA的快速提取、基因PCR扩增、DNA电泳、PCR产物纯化、DNA酶切、遗传学分析等实验方法及注意事项。（3）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天平、PCR仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、恒温振荡摇床、37℃培养箱、pH计、微量移液器、冰箱、-80℃超低温冰箱等主要仪器设备以及必须的电脑软件的使用方法、注意事项；4.2PTC尝味能力的测定4.2.1实验材料4.2.1.1主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。洁净、经121℃高压灭菌20min的容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次性医用无菌PE手套、乳胶手套、塑料滴管，一次性纸杯，记号笔。4.2.1.2试剂和材料（1）材料：受试者为全体修读遗传学大实验的学生。（2）试剂：苯硫脲（PTC）结晶，娃哈哈纯净水.4.2.1.3溶液配制（1）原液（1号液）：称取PTC结晶0.65g，加娃哈哈纯净水500ml，在室温(20℃左右)下溶解l~2d（经常摇晃）（或60℃水浴中1h充分溶解），PTC浓度约为1／750，过滤灭菌。（2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原